宋 蕾，張建國，劉英勛

（山東省青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，青島 266109）

膿毒癥主要是由感染引發(fā)的全身炎癥反應的綜合征，是ICU 常見的一種疾病，感染源主要有真菌、病毒、細菌和寄生蟲等，嚴重時可引發(fā)休克或死亡，病死率高達30%[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，每年超過3 000萬人次確診為膿毒癥，其發(fā)病機制較為復雜，可導致心、肝、腎等重要器官損傷[3-4]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌感染疾病的主要因素，也常用于誘導建立膿毒癥細胞模型[5]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）小核仁RNA 宿主基因3（SNHG3）在多種疾病中異常表達，位于染色體1p35.3上，與多種疾病的增殖、凋亡等生物學過程密切相關(guān)[6]。Zhang等[7]研究結(jié)果顯示，SNHG3在缺氧和葡萄糖剝奪誘導腦微血管內(nèi)皮細胞（BMVEC）中高表達，利用干擾shRNA技術(shù)，沉默SNHG3 可以明顯抑制葡萄糖剝奪誘導腦微血管內(nèi)皮細胞BMVEC 的增殖、轉(zhuǎn)移，誘導其細胞凋亡，但是在膿毒癥的研究尚不明確。miRNA 可以作為膿毒癥的潛在生物標志物，如miR-25、miR-133a、miR-146、miR-150 和miR-223 等，與疾病的分期、預后有關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-410-3p 在LPS 誘導的小鼠心肌細胞中低表達，miR-410-3p 通過抑制TLR2減緩膿毒癥心肌細胞的損傷[9]。因此，本研究通過LPS誘導建立膿毒癥血管內(nèi)皮細胞模型，探討SNHG3 通過調(diào)控miR-410-3p 對膿毒癥血管內(nèi)皮細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，旨在為膿毒癥的研究提供新的潛在標志物。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2018 年7 月至2019 年2 月青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院收治的25例膿毒癥患者（研究組）以及同期在本院行體格檢查的25例健康志愿者（對照組）的血清，其中對照組排除血液系統(tǒng)疾病、嚴重肝、腎功能障礙等。研究組中男15 例，女10例，年齡18～65 歲；對照組中男12 例，女13 例，年齡23～57歲。本研究已取得本院倫理委員會批準。所有參與者均已簽署知情同意書。

1.2 細胞和主要試劑 人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）購自美國ATCC 公司。LPS、MTT 試劑盒購自美國Sigma公司；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒、Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、anti-miR-NC 和anti-miR-410-3p 購自廣州銳博公司；引物購自上海吉瑪公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自大連寶豐公司；凋亡試劑盒購自碧云天公司；CyclinD1抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；IgG抗體購自北京百奧萊博公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和處理 HUVECs用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVECs 接種于6 孔板，每孔3×104個，用10 μg/mL 的LPS 處理細胞后，將si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、antimiR-NC 和anti-miR-410-3p 轉(zhuǎn)染至HUVECs 細胞。轉(zhuǎn)染時參照Lipofectamine 2000 說明書進行，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞。正常培養(yǎng)且未轉(zhuǎn)染的細胞作為對照（Con組）。

1.4 qRT-PCR 法檢測SNHG3 和miR-410-3p 的表達 取血清及HUVECs細胞，Trizol法提取總RNA，檢測其濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配置反應體系，以cDNA 為模板，在ABI 7500 型PCR 儀（Applied Biosystems公司）上進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性6 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共40 個循環(huán)。SNHG3 和miR-410-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算SNHG3和miR-410-3p相對表達量。引物序列如下：SNHG3 上游：5’-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3’，下游：5’-TGCTCCAAGTCTGCCAAAGA-3’；miR-410-3p 上游：5’-CCGCCA ATATAACACAGATGGCC-3’，下游：5’-GGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGC-3’。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖 收集HUVECs，以1×104個/孔細胞密度接種于96 孔板，培養(yǎng)48 h 后棄去各組細胞培養(yǎng)基，每孔內(nèi)加入20 μL MTT 溶液，4 h后加入150 μL DMSO試劑，遮光反應5 min，用酶標儀檢測各孔490 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集HUVECs細胞，以4×105個/孔細胞密度接種于6 孔板，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細胞，參照凋亡試劑盒說明書，分別加入5μL Annexin V-FITC 及10μL PI 試劑，避光反應15 min 后置于流式細胞儀，計算細胞凋亡率。

1.7 Western blotting 法檢測CyclinD1、Bax 蛋白表達 收集HUVECs 細胞，裂解后提取細胞總蛋白，取20 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗（CyclinD1、Bax 均為1:500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（1:2 000）室溫孵育2 h；ECL顯影、曝光，Lane 1D軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.8 雙熒光素酶實驗驗證SNHG3和miR-410-3p的靶向關(guān)系 Starbase 預測SNHG3 和miR-410-3p 互補結(jié)合序列，構(gòu)建SNHG3 野生型載體（SNHG3-wt）和突變型載體（SNHG3-mut），并與miR-NC 或miR-410-3p共轉(zhuǎn)染至HUVECs細胞，收集轉(zhuǎn)染24 h的細胞，按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學方法 用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG3 和miR-410-3p 在膿毒證患者血清及LPS 誘導的HUVECs 中的表達 與對照組比較，研究組血清SNHG3 表達顯著升高，miR-410-3p 表達顯著降低（均P＜0.05），見表1；與Con 組比較，LPS組SNHG3 表達顯著升高，miR-410-3p 表達顯著降低（均P＜0.05），見表2。

表1 SNHG3和miR-410-3p在膿毒證患者血清中的表達，n=25

表1 SNHG3和miR-410-3p在膿毒證患者血清中的表達，n=25

與對照組比較，*P＜0.05。

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS誘導的HUVECs中的表達

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS誘導的HUVECs中的表達

與Con組比較，*P＜0.05。

2.2 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組SNHG3 表達、細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著升高，細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低（均P＜0.05）；與LPS+si-NC組比較，LPS+si-SNHG3組SNHG3表達、細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著降低，細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著升高（均P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表3 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表3 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與Con組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC組比較，#P＜0.05。

2.3 SNHG3調(diào)控miR-410-3p的表達 通過在線生物信息網(wǎng)預測了SNHG3和miR-410-3p存在互補的核苷酸序列，見圖2。與miR-NC 組比較，miR-410-3p組SNHG3-wt熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而SNHG3-mut熒光素酶活性沒有顯著變化，見表4。

表4 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG3與miR-410-3p的靶向關(guān)系

表4 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG3與miR-410-3p的靶向關(guān)系

與miR-NC組比較，*P＜0.05。

2.4 過表達miR-410-3p 對LPS 誘導的HUVECs 增殖和凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組miR-410-3p 表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著升高（均P＜0.05）；與LPS+miR-NC 組比較，LPS+miR-410-3p 組miR-410-3p表達、細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著降低（均P＜0.05），見圖3、表5。

表5 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表5 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與Con組比較，*P＜0.05；與LPS+miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖3 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

2.5 抑制miR-410-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響 與LPS+si-NC組比較，LPS+si-SNHG3組miR-410-3p表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著降低（均P＜0.05）；與LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC 組比較，LPS+si-SNHG3+antimiR-410-3p 組miR-410-3p 表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著升高（均P＜0.05），見圖4、表6。

表6 抑制miR-410-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表6 抑制miR-410-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與LPS+si-NC組比較，*P＜0.05；與LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖4 抑制miR-410-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

3 討論

休克、急性肺損傷、心肌損傷均為膿毒癥常見的并發(fā)癥，也是膿毒癥病死率較高的主要原因[10]。近年來越來越多的研究表明，lncRNA 在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。張思敏等[11]研究顯示，過表達FEZF1-AS1 或抑制miR-363-3p 可明顯抑制LPS 誘導HUVECs 增殖并促進凋亡，提示lncRNA FEZF1-AS1 靶向調(diào)控miR-363-3p 的表達抑制膿毒癥的發(fā)生。Zhang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1 在膿毒癥患者肝組織和LPS 誘導的Raw264.7 細胞中表達上調(diào)，其通過調(diào)控Let-7a/TLR4 軸減輕LPS 誘導的肝損傷。Wu等[13]發(fā)現(xiàn)，沉默HOTAIR可以保護LPS誘導的膿毒癥小鼠的心臟功能。此外，有學者通過微陣列篩查差異表達lncRNA，發(fā)現(xiàn)MEG3在膿毒癥患者的血清中表達上調(diào)，與較高的死亡率和不良預后有關(guān)；沉默MEG3 可以抑制LPS 誘導的腎上皮細胞和心肌細胞凋亡[14]。Shan等[15]通過LPS刺激心肌細胞建立膿毒癥心肌細胞模型，結(jié)果顯示，H19在LPS誘導的心肌細胞中表達下調(diào)，過表達H19可明顯抑制LPS 誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應；H19 通過調(diào)節(jié)miR-93-5p/SORBS2軸抑制膿毒癥誘發(fā)的心肌細胞損傷。SNHG3在多種癌癥中表達上調(diào)，與腫瘤的大小、晚期TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良的預后顯著相關(guān)，參與細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程[16-17]。SNHG3 在肝癌組織中表達上調(diào)，敲低SNHG3可以明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進癌細胞凋亡，SNHG3 調(diào)控miR-326促進肝癌細胞發(fā)展[18]。本研究中，SNHG3在膿毒癥患者血清和LPS誘導HUVECs細胞中的表達上調(diào)，沉默SNHG3 明顯抑制LPS 誘導HUVECs 增殖，誘導細胞凋亡，說明SNHG3 可以作為膿毒癥的潛在生物標志物。

miRNA 是非編碼RNA 的一員，沒有編碼蛋白的功能，可抑制或促進mRNA的翻譯及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達，進而參與膿毒癥的發(fā)展[19]。黃鐘等[20]建立膿毒癥大鼠模型，結(jié)果顯示miR-128-3p 表達上調(diào)，沉默miR-128-3p 可明顯減緩大鼠急性肺損傷，抑制大鼠肺細胞凋亡和炎癥反應。Yuan等[21]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-30a可抑制膿毒癥大鼠肝細胞增殖并誘導細胞凋亡；miR-30a 負調(diào)控SOCS-1 激活JAK/STAT 信號通路調(diào)控膿毒癥誘發(fā)的肝損傷。miR-126a-3p 在LPS 誘導的小鼠血管內(nèi)皮細胞中表達下調(diào)，過表達miR-126a-3p 可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并誘導細胞凋亡[22]。

SNHG3 可調(diào)控下游多個miRNA 的表達，通過在線數(shù)據(jù)庫顯示，SNHG3 與miR-410-3p 存在互補結(jié)合位點。miR-410-3p 在多種癌癥和疾病中異常表達，如miR-410-3p在類風濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織和成纖維細胞樣滑膜細胞中表達下調(diào)，miR-410-3p通過下調(diào)YY1抑制類風濕關(guān)節(jié)炎細胞的增殖，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示，miR-410-3p在膿毒癥患者血清和LPS誘導HUVECs中表達下調(diào)，過表達miR-410-3p可明顯抑制LPS誘導HUVECs細胞增殖，誘導細胞凋亡。進一步實驗結(jié)果顯示，SNHG3 可靶向調(diào)控miR-410-3p 的表達，抑制miR-410-3p逆轉(zhuǎn)了沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs 增殖和凋亡的作用。提示沉默SNHG3 可能通過上調(diào)miR-410-3p 表達抑制膿毒癥的發(fā)展，SNHG3/miR-410-3p 可作為膿毒癥的診斷和治療的新靶點。