姚春和，張 榮

（陜西省延安大學(xué)咸陽醫(yī)院 1.普通外科一病區(qū) 2.消化內(nèi)科二病區(qū)，咸陽 712000）

結(jié)腸癌是我國常見的高發(fā)性消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率均有明顯攀高趨勢[1]。結(jié)腸癌中存在著許多異常表達(dá)的微小RNAs（microRNAs，miRNAs），而這些miRNAs 可通過調(diào)控多種靶基因影響細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)功能[2-4]。已有研究證實，miR-372 在結(jié)腸癌組織和血液中高表達(dá)，與腫瘤大小和腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且與大腫瘤抑制同系物2（large tumor suppressor homolog 2，LATS2）之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[5-6]；而LATS2在結(jié)腸癌惡性進展中發(fā)揮著重要的抑制作用[7]。有研究指出，miR-372 可通過靶向調(diào)控LATS2 表達(dá)促進乳腺癌細(xì)胞增殖，而抑制miR-372 表達(dá)可通過調(diào)控LATS2 表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移[8-9]。猜測miR-372可能通過靶向調(diào)控LATS2促進結(jié)腸癌惡性進展。因此，本研究以人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞為研究對象，通過觀察miR-372 與LATS2 的靶向關(guān)系，探討miR-372靶向調(diào)控LATS2對SW620細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，旨在闡明miR-372在結(jié)腸癌中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 購于美國ATCC，miR-372模擬物及其陰性對照購于廣州銳博生物。脂質(zhì)體2000 和PVDF 膜購于美國Invitrogen 公司，MTT 試劑、青霉素－鏈霉素溶液（100×）、ECL 顯色液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、BCA 定量試劑盒和熒光素酶試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜購于南京凱基生物公司。PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq 試劑盒購于TaKaRa 公司，Transwell小室購于美國BD Bioscience 公司，CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Scientific 公司，pLV-LATS2 慢病毒載體質(zhì)粒購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司，兔抗人LATS2抗體購于英國Abcam公司，兔抗人β-actin抗體購于武漢博士德公司。PCR 引物由上海生工設(shè)計合成。

1.2 SW620細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將凍存的SW620細(xì)胞以溫水浴解凍復(fù)蘇后，以DEME 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素）于37 ℃、飽和濕度、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的SW620 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種至6 孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。將其分為對照組（未處理）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-372模擬物陰性對照）、miR-372組（轉(zhuǎn)染miR-372 模擬物）、pLV-LATS2 組（轉(zhuǎn)染pLVLATS2 質(zhì)粒）和miR-372+LATS2 組（轉(zhuǎn)染miR-372模擬物和pLV-LATS2 質(zhì)粒）。待細(xì)胞融合度超過75%時，參照脂質(zhì)體2000 說明書步驟將miR-372 模擬物及其對照和pLV-LATS2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW620 細(xì)胞中。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-372 和LATS2 mRNA 的表達(dá) 胰蛋白酶收集轉(zhuǎn)染48 h 后的miR-372組、miR-NC組和對照組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計法測定總RNA 濃度。以1 μg RNA 為模板利用PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。再以cDNA 為模板利用SYBR Premix Ex Taq 在ABI 7500 型PCR 儀上進行PCR 擴增。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板2 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL，配置25 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s；然后在95 ℃5 s 和60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。miR-372 上游引物：5’-TCGACAAAGTG CTGC GACATTT-3’，下 游：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’；U6 上游引物：5’-CGCTTCGGCA GCACATATAC-3’，下游：5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；LATS2 上游引物：5’-TGGCACCTAC TCCCACAG-3’，下游：5’-CCAAGGGCTTTCTTCATCT-3’；GAPDH 上游引物5’-TCATGGGTGTGA ACCATGAGAA-3’，下游：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。采用2-ΔΔCt法計算miR-372 和LATS2 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.4 熒光素酶實驗測定 TargetScan軟件在線預(yù)測顯示miR-372與LATS2的3’UTR存在結(jié)合位點，為了驗證miR-372 與LATS2 有無靶向關(guān)系，構(gòu)建LATS2 3’UTR 的野生型（LATS2-WT）、突變型（LATS2-MUT）熒光數(shù)酶報告載體。參照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000 說明書步驟行miR-NC+LATS2-WT、miR-NC+LATS2-MUT、miR-372+LATS2-MUT 和miR-372+LATS2-MUT 四組共轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞測定細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.5 Western blotting 檢測LATS2 蛋白的表達(dá) 胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h 后的miR-372 +LATS2組、pLV-LATS2 組、miR-372 組和對照組細(xì)胞，蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞20 min以提取總蛋白，隨后按照BCA試劑盒說明書進行蛋白定量。按照5×上樣緩沖液：蛋白體積=1:4 比例加入上樣緩沖液，于沸水中煮5 min 變性。將蛋白樣品以每孔60 μg 上樣至SDS-PAGE凝膠孔中，先以80 V電壓行蛋白濃縮30 min，再以120V電壓行蛋白分離70 min。接著以100 V 電壓轉(zhuǎn)PVDF 膜70 min。采用含去脂奶粉的封閉液搖床孵育4 h 后，4 ℃下加入LATS2 一抗（1:200）、內(nèi)參β-actin（1:800）孵育過夜，次日封閉液洗膜后，常溫下加入二抗（1:1 000）孵育1 h。ECL顯色液顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度值。LATS2 蛋白表達(dá)量以其灰度值和內(nèi)參β-actin 條帶灰度值比值表示。

1.6 MTT法測定SW620細(xì)胞增殖 胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-372+LATS2組、pLV-LATS2組、miR-372組和對照組細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至96孔細(xì)胞板上，每組設(shè)6 個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)1 d、2 d和3 d后，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL。孵育4 h 后，加入二甲基亞砜100 μL 至藍(lán)紫色結(jié)晶溶解，上酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各組細(xì)胞的吸光度值。

1.7 Transwell小室法測定SW620細(xì)胞侵襲和遷移 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的對照組、miR-372 組、pLVLATS2組和miR-372+LATS2組細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個/mL 單細(xì)胞懸液。在包被或未包被無基質(zhì)膠包被的Transwell 小室上室中加入200 μL細(xì)胞液，下室中加入600 μL含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。拭去上室內(nèi)未穿過濾膜的細(xì)胞，采用4%多聚甲醛對膜下細(xì)胞固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下隨機選取5個視野行細(xì)胞計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-372 模擬物后SW620 細(xì)胞中miR-372 表達(dá)升高而LATS2 mRNA 表達(dá)降低 miR-372組細(xì)胞中miR-372 的表達(dá)水平顯著高于對照組，而LATS2 mRNA 的表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）；而miR-NC組細(xì)胞中miR-372 和LATS2 mRNA的表達(dá)水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞中miR-372和LATS2 mRNA的相對表達(dá)量

表1 各組細(xì)胞中miR-372和LATS2 mRNA的相對表達(dá)量

與對照組相比，＊P＜0.05。

2.2 miR-372 直接靶向作用于LATS2 采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LATS2 3’UTR 存在可與miR-372 互補的核苷酸序列，見表2。同時，與miRNC+LATS2-WT 組相比，miR-372+LATS2-WT 組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而miRNC+LATS2-MUT 組與miR-372+LATS2-MUT 組細(xì)胞的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 LATS2 3'UTR與miR-372互補結(jié)合位點

表3 各組細(xì)胞的熒光素酶活性

表3 各組細(xì)胞的熒光素酶活性

與miR-NC+LATS2-WT組相比，＊P＜0.05。

2.3 miR-372 可 負(fù)向調(diào)控SW620 細(xì)胞中LATS2 蛋白的表達(dá) miR-372組細(xì)胞LATS2蛋白的表達(dá)水平較對照組顯著降低，而pLV-LATS2組細(xì)胞中LATS2蛋白表達(dá)較對照組顯著升高；且miR-372+LATS2組細(xì)胞中LATS2 蛋白表達(dá)顯著高于miR-372 組（P＜0.05），見圖1和表4。

表4 各組細(xì)胞中LATS2蛋白的相對表達(dá)量

表4 各組細(xì)胞中LATS2蛋白的相對表達(dá)量

與對照組相比，＊P＜0.05；與miR-372組相比，#P＜0.05。

圖1 Western blotting檢測LATS2蛋白的表達(dá)

2.4 miR-372靶向LATS2促進SW620細(xì)胞增殖 與對照組相比，miR-372組細(xì)胞在1～3 d的增殖活力顯著增強，而pLV-LATS2 組顯著減弱，且miR-372+LATS2 組的增殖活力顯著低于miR-372 組（P＜0.05），見表5。

表5 各組細(xì)胞的吸光度值

表5 各組細(xì)胞的吸光度值

與對照組相比，*P＜0.05；與miR-372組相比，#P＜0.05。

2.5 miR-372 靶向LATS2 促進SW620 細(xì)胞的侵襲和遷移 相對于對照組，miR-372 組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增多，pLV-LATS2 組中均顯著減少（P＜0.05）；且miR-372+LATS2 組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著低于miR-372組（P＜0.05），見圖2和表6。

圖2 各組細(xì)胞的侵襲和遷移

表6 各組中的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)

表6 各組中的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)

與對照組相比，*P＜0.05；與miR-372組相比，#P＜0.05。

3 討論

由于多數(shù)結(jié)腸癌患者確診時已發(fā)生局部轉(zhuǎn)移，錯失了根治性手術(shù)治療的最佳時期，而目前常用的抗腫瘤藥物治療結(jié)腸癌的效果不佳。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，具有較強特異性的分子靶向治療逐漸成為癌癥治療的重要手段，而結(jié)腸癌中異常表達(dá)的miRNAs 是治療靶點的重要來源。因此，深入研究miRNAs 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，篩選新的有效的miRNAs 對結(jié)腸癌治療具有重要意義。miR-372 是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的miRNA，其異常高表達(dá)可通過調(diào)控下游多種靶基因表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程?？谇击[狀細(xì)胞癌中miR-372 表達(dá)上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管侵犯和生存率低有關(guān)，且可通過靶向調(diào)控p62調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡發(fā)揮致癌作用[10-11]。miR-372 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中異常高表達(dá)，干擾其表達(dá)可通過靶向調(diào)控PHLPP2 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡，并抑制細(xì)胞增殖和侵襲[12]。在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中miR-372過表達(dá)并通過靶向抑制FGF9表達(dá)促進癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]；上調(diào)肝癌中miR-372 表達(dá)可通過靶向調(diào)控PTEN 增強YB-1表達(dá)促進肝癌細(xì)胞生長[14-15]。

在結(jié)腸癌中，miR-372被證實異常高表達(dá)，與腫瘤大小和腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且與LATS2之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[5-6]。LATS2屬于拉特抑癌家族成員，可通過調(diào)控p53 基因、Ras-ERK 和Hippo 信號通路影響細(xì)胞周期、增殖和凋亡等介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-17]。LATS2被證實在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮著重要的抑制作用[18-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-372可通過靶向調(diào)控LATS2促進乳腺癌細(xì)胞增殖，而抑制其表達(dá)可通過調(diào)控LATS2表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移[8-9]。本研究通過熒光素酶實驗證實LATS2 是miR-372 的靶基因，同時通過轉(zhuǎn)染miR-372模擬物上調(diào)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中miR-372表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，SW620 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯增強；而轉(zhuǎn)染LATS2 慢病毒表達(dá)載體后，上調(diào)LATS2 表達(dá)顯著降低miR-372 對SW620 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響（P＜0.05）。上述結(jié)果提示，miR-372 可通過靶向調(diào)控LATS2 促進SW620 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，LATS2 是miR-372 的潛在靶基因，miR-372 可通過靶向下調(diào)LATS2 促進癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，進而在結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌作用。該結(jié)果進一步豐富了miR-372在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的致癌機制，也為miR-372 有望成為結(jié)腸癌治療的后選靶基因提供了新的實驗依據(jù)。