張華穎，劉 鑫，宋秋露，韋可璇，林春香，趙 偉△

（廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院 1.放療科；2.消化內科,南寧 530000）

原發(fā)性肝癌（肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一，其在我國的發(fā)病例數超過世界總例數的50%[1]。放射治療是中、晚期肝癌患者有效的治療方式之一[2-3]。然而，放射抗拒嚴重影響了肝癌放射治療的效果。因此，提高肝癌放射治療的敏感性，對提高肝癌的治療效果有重要的臨床意義。DNA 是放射治療的靶點，放射治療可導致DNA損傷并誘導腫瘤細胞凋亡[4]。自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和放射抗拒密切相關[5-6]。但自噬在肝癌細胞DNA 放射損傷反應中的作用及影響目前仍未闡明。因此，本研究以肝癌SMMC-7721 細胞作為研究對象，檢測電離輻射（ionizing radiation，IR）后細胞DNA 損傷情況，觀察激活和抑制自噬對SMMC-7721 細胞DNA 損傷修復的影響，為提高肝癌放射敏感性提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人肝癌SMMC-7721細胞購自中南大學湘雅醫(yī)學院。彗星電泳法檢測細胞損傷試劑盒（KGA240-50）購自凱基生物公司；自噬激活劑雷帕霉素（Rapamycin）購買于美國Sigma公司；自噬抑制劑3-甲基腺（3-MA）購買于上海愛必信生物公司；微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3（LC3）B 抗體、絲氨酸139 磷酸化形式的組蛋白（γ-H2AX）抗體購自美國Abcam 公司；BCA 定量測蛋白濃度試劑盒、RIPA裂解液、GAPDH、山羊抗兔lgG（H+L）和驢抗兔lgG(H+L)均購自上海碧云天公司；β-actin 購自美國Santa Cruz 公司；DMEM（10566016）高糖培養(yǎng)基、FBS（A3161001）購自美國GIBCO公司；青霉素和鏈霉素混合液和PBS 緩沖液購自北京Solarbio 公司；ECL發(fā)光試劑盒（34577）購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌SMMC-7721 細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細胞匯合度達到70%時，將細胞分為4組，即對照（NC）組、單純照射（IR）組、IR+自噬激活劑雷帕霉素（Rapamycin）組和IR+自噬抑制劑三甲基腺嘌呤（3-MA）組。IR 組SMMC-7721 細胞用不同劑量X 射線（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy）照射不同時間（24 h、48 h）。IR+Rapamycin 組和IR+3-MA 組分別 用20 nmol/L Rapamycin、8 mmol/L 3-MA 處理細胞，6 h后用8 Gy X射線照射細胞。

1.3 彗星實驗檢測DNA 損傷 將100 μL 1%正常熔點瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，置于4 ℃下10 min使NMA凝固；將細胞（105個）與75 μL 0.75%低熔點膠（LMA）混合均勻，置于4 ℃下10 min 使LMA凝固。第二層膠凝固后滴加75 μL的LMA，蓋上蓋玻片4 ℃下凝固30 min。將玻片放入預冷的Lysis Buffer，裂解細胞2 h。載玻片在電泳液(300 mmol/L NaOH、1 mmol/L EDTA)中解旋20 min。調節(jié)電流300 mA，電壓25 V，電泳20 min。將載玻片放入PBS 緩沖液（pH 7.2～7.4）中，30 min后PI 染色10 min，用熒光顯微鏡觀察細胞，每張玻片隨機選取至少50個拖尾細胞，用CASP軟件測量Olive尾距。

1.4 Western blotting 法檢測細胞γ-H2AX 和LC3B蛋白表達 取NC組和IR組細胞，用RIPA液裂解細胞，離心收集蛋白，測定蛋白濃度，用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜上，TBST 洗膜3 次，室溫封閉20 min，加入一抗LC3B(1:2 000)、γ-H2AX(1:2 000)、β-actin(1:1 000)、GAPDH (1:1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗（1:1 000）室溫孵育1 h，使用增強化學發(fā)試劑（ECL）顯色。用Image J 軟件分析蛋白相對表達量。

1.5 免疫熒光檢測γ-H2AX和LC3B蛋白表達 除去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 洗3 次，用免疫封閉液封閉1 h。孵育相應一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，37 ℃孵育熒光二抗1 h，再用DAPI 染細胞核5 min。在EVOS FL自動顯微鏡下觀察細胞LC3B蛋白綠色免疫熒光標記的面積和γ-H2AX 蛋白紅色熒光焦點數。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 照射對肝癌SMMC-7721細胞DNA的影響 Western blotting結果顯示，SMMC-7721細胞照射組與未照射（0 Gy）組相比，γ-H2AX 蛋白表達上調，隨著照射劑量增加，γ-H2AX蛋白表達呈升高趨勢，在10 Gy時γ-H2AX蛋白表達最高，DNA損傷最為嚴重（P＜0.05）（圖1A）；彗星實驗顯示，IR 組與NC 組相比較DNA 損傷Olive 尾距增加（P＜0.05），見圖1B。

圖1 照射對SMMC-7721細胞DNA的影響

2.2 照射對肝癌SMMC-7721細胞自噬的影響 Western blotting 結果顯示，隨著照射時間和劑量的增加，IR 組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增加，但照射劑量超過6 Gy后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低（圖2A）；免疫熒光分析結果顯示，與NC 組相比，IR 組LC3B標記的熒光斑點數隨著照射時間延長明顯增加，48 h尤為顯著，見圖2B。

圖2 照射對SMMC-7721細胞自噬的影響

2.3 激活和抑制自噬對肝癌SMMC-7721 細胞DNA放射損傷的影響 免疫熒光結果顯示，不同時間點（0 h、4 h、24 h）細胞γ-H2AX的熒光焦點數有明顯差異，IR 組在4 h γ-H2AX 熒光焦點數最多，24 h熒光斑點數目逐漸下降，DNA損傷基本修復；IR+3-MA 組在4 h 和24 h 時γ-H2AX 熒光焦點數多于IR組和IR+Rapamycin 組（P＜0.05），IR+Rapamycin 組在4 h 和24 h 時γ-H2AX 熒光焦點數少于IR+3-MA組和IR組（P＜0.05），見圖3。

圖3 激活和抑制自噬對肝癌SMMC-7721細胞DNA放射損傷的影響

3 討論

放射治療是腫瘤重要治療策略之一。放射治療的靶點是DNA，可直接或間接誘導DNA損傷，達到殺傷腫瘤細胞的效果[7]。因此，探討抑制DNA損傷修復的機制，增加放射敏感性顯得尤為重要。

DNA 損傷包括堿基損傷、單鏈斷裂、雙鏈斷裂等。DNA 損傷的程度決定了細胞最終的結局，當DNA 損傷較輕時，可觸發(fā)細胞內DNA 損傷修復機制，細胞得以存活[8]。但當DNA 損傷嚴重時，細胞將走向凋亡和壞死的結局[9]。γ-H2AX是DNA損傷的關鍵成分，γ-H2AX 焦點的形成可作為DNA 損傷的重要指標[10]。本研究發(fā)現，照射后SMMC-7721細胞DNA 發(fā)生嚴重的斷裂，隨著照射劑量的增加γ-H2AX蛋白表達增加，DNA損傷程度加重。

自噬是真核生物細胞內一種蛋白降解過程。研究表明，在饑餓、低氧、感染和DNA損傷等應激條件下自噬被誘導激活，以減少細胞損傷維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[6]。自噬失調時會導致過早衰老、神經退行性疾病、心血管疾病和癌癥等人類相關性疾病[11-12]。自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起雙重作用，但在大多數情況下自噬促進了腫瘤的發(fā)生[13]。越來越多的研究發(fā)現，在腫瘤細胞中自噬表達水平增加。因此，自噬逐漸成為腫瘤治療一個潛在的靶點。在本研究發(fā)現SMMC-7721細胞照射后與NC組相比，IR組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ表達增加，在48 h 時LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉化增多，自噬水平增加。結果表明，照射可誘導SMMC-7721 細胞自噬激活，48 h 時自噬激活相對增多。

自噬和DNA 修復是維持細胞正常狀態(tài)的生物學過程，自噬可參與DNA損傷修復，然而DNA損傷修復與自噬之間的關系仍不清楚[14]。有研究表明，雷帕霉素激活自噬通過Stat3 信號通路降低骨髓血細胞DNA 放射損傷[15]。在Hela 細胞中自噬缺陷誘導p62 積聚導致了組蛋白泛素化的抑制，并抑制DNA 修復，增加體內和體外細胞對放射的敏感性[16]。AKT 抑制劑在惡性膠質瘤中誘導自噬具有放射增敏作用[17]。本研究通過激活和抑制自噬觀察DNA 損傷的情況，發(fā)現照射后SMMC-7721 細胞γ-H2AX蛋白在4 h表達最高，說明DNA損傷最嚴重，24 h DNA 損傷降至基礎水平；雷帕霉素激活自噬，γ-H2AX 蛋白在同一時間點較其他組表達低，說明DNA損傷修復時間縮短，促進了DNA損傷修復；當3-MA抑制自噬時，與對照組相比γ-H2AX蛋白表達增加，說明DNA 修復時間延長，細胞DNA 損傷加重，與以往的研究[18-19]相一致。結果表明，自噬對DNA損傷起保護性作用，抑制自噬可增加放射敏感性。

綜上所述，照射可誘導肝癌SMMC-7721 細胞發(fā)生DNA 斷裂損傷，同時激活自噬；自噬可促進放射線所致的DNA 損傷的修復。但本研究僅在體外進行驗證，自噬與DNA損傷修復之間的關系還需大量的實驗來證明。