石春光，黃 琛，胡益森，蘇天柱，徐 戈△

（1.廣西南寧市武鳴區(qū)中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科，武鳴 530199；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530001；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧 530023）

急性心肌梗死是世界上導(dǎo)致患者死亡常見的心血管疾病之一[1]。心肌梗死后常發(fā)生心肌重構(gòu)，是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的一種病理生理機(jī)制[2]。心肌間質(zhì)纖維化是心肌重構(gòu)的重要的組成部分[3-4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Smad 家族轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步調(diào)控纖維化相關(guān)基因表達(dá)，最終在心肌間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5-6]。Smad2 作為Smad 家族轉(zhuǎn)錄因子的重要成員之一，是TGF-β信號(hào)通路上關(guān)鍵的調(diào)控因子[7-8]。研究表明，TGF-β1/Smad2信號(hào)通路在心肌梗死大鼠心室重構(gòu)和心肌纖維化方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9-10]。丹酚酸A（salvianolic acid A,SAA）是一種從中藥丹參中提取的有效化合物，具有抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥反應(yīng)的作用[11-13]。近年來研究表明，丹酚酸A 能夠減輕四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化[14]。然而，丹酚酸A 對(duì)心肌梗死大鼠的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討丹酚酸A 對(duì)心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠，體重（280±10）g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2020-0003，使用許可證號(hào)：SCXK 桂2020-0004。所有動(dòng)物在室溫25 ℃、相對(duì)濕度50%、12 h/12 h晝夜明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物和主要試劑 丹酚酸A 購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司。Masson 試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；肌鈣蛋白T 檢測(cè)試劑盒、NT-proBNP 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢優(yōu)爾生科技股份公司；CK-MB檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成公司。一抗TGF-β1、磷酸化（p-）Smad2、Smad2、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ抗體均購(gòu)自Abcam 公司；紅外標(biāo)記熒光二抗購(gòu)自CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與造模 將24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丹酚酸A組，每組8只。所有大鼠用戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，連接心電圖，進(jìn)行氣管插管，在左胸壁第3與第4肋間剃毛，鋪巾，碘伏消毒，開胸，破心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下2 mm 處穿線，模型組和丹酚酸A 組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎后心肌呈灰白色，心電圖Ⅱ?qū)?lián)抬高（振幅>0.2 mV）為心肌梗死造模成功標(biāo)志。假手術(shù)組大鼠僅穿線不結(jié)扎。3組大鼠手術(shù)后逐層關(guān)胸，消毒手術(shù)切口，待大鼠蘇醒，繼續(xù)正常飼養(yǎng)。造模后，丹酚酸A組腹腔注射10 mg/kg丹酚酸A（溶于生理鹽水）[15-16]，1次/d，連續(xù)4周。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 大鼠心功能檢測(cè) 給藥結(jié)束后，戊巴比妥麻醉大鼠，固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，行右側(cè)頸動(dòng)脈插管，待左室壓力曲線穩(wěn)定后，通過MPA心功能分析儀檢測(cè)大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室收縮壓力（LVSP）、左心室壓力上升的最大變化率（+dp/dtmax）和左心室壓力下降的最大變化率（-dp/dtmax）。監(jiān)測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算各指標(biāo)的平均值。

1.5 樣本收集 大鼠心功能檢測(cè)完畢后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，4 000 r/min 離心20 min，取上清，分裝保存至-80 ℃冰箱。處死大鼠，剪取大鼠心臟，取心肌梗死邊緣區(qū)，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，快速剪取一部分心肌組織保存于-80 ℃冰箱中，另一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 取各組大鼠血清，采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平。檢測(cè)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明說操作。

1.7 Masson 染色檢測(cè)心肌纖維化 取各組心肌組織，梯度乙醇脫水，充分浸泡于二甲苯，石蠟包埋，常規(guī)切片，行Masson 染色，顯微鏡觀察心肌組織纖維化情況。使用Image J軟件分析纖維化面積，計(jì)算藍(lán)色區(qū)域的面積（纖維化區(qū)域）與紅色區(qū)域的面積（正常心?。┑谋戎担茨z原容積分?jǐn)?shù)。

1.8 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ纖維化相關(guān)蛋白表達(dá) 取心肌組織切片，脫蠟，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA 室溫封閉30 min，一抗4 °C 孵育過夜，二抗孵育1 h，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野，觀察染色結(jié)果，棕黃色顆粒即為陽性細(xì)胞。用Image J 軟件測(cè)量每張圖片的累積光密度（IOD）以及區(qū)域面積，計(jì)算平均光密度（AOD），AOD=IOD/面積。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達(dá) 取心肌組織，加入適量RIPA裂解液，充分研磨，低溫離心，取上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加熱使蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗Smad2（1∶1 000），p-Smad2（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育過液，洗膜3次；熒光二抗（1∶14 000）室溫孵育2 h，用Odyssey 雙色紅外極光成像儀（LICOR 公司）掃膜。用Image J 軟件分析TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A 改善心肌梗死大鼠的心功能 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDP 明顯升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低（均P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組大鼠LVEDP 明顯降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯升高（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠心功能比較，n=8

表1 3組大鼠心功能比較，n=8

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05。

2.2 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠血清心肌肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 與假手術(shù)組比較，模型組血清中肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A組血清中肌鈣蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組大鼠血清肌鈣蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平比較

2.3 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù) 與假手術(shù)組比較，模型組CVF 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組CVF 明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 3組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.4 丹酚酸A 減少心肌梗死大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 3組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)比較

2.5 丹酚酸A 減少心肌梗死大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A組大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 3組大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)比較

3 討論

急性心肌梗死是導(dǎo)致患者死亡的重要心血管疾病之一，其發(fā)生后常伴隨心肌重構(gòu)；心肌間質(zhì)膠原沉積是心肌重構(gòu)的重要特征[17]。大多數(shù)心肌膠原纖維是由Col-Ⅰ、Col-Ⅲ組成，其中Col-Ⅰ占健康心臟中約80%的膠原蛋白[18]。在正常生理狀態(tài)下，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等膠原蛋白的合成和分解處于動(dòng)態(tài)平衡中；然而在某些病理?xiàng)l件下，如心肌梗死發(fā)生后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等膠原蛋白的合成多于分解導(dǎo)致過多的膠原蛋白沉積在心肌間質(zhì)，進(jìn)而發(fā)展成心肌纖維化[19-20]。Qiang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A 能夠預(yù)防高脂飲食喂養(yǎng)和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝纖維化的病理進(jìn)展。Zhu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A通過SIRT1/HSF1 信號(hào)通路減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并防止膽汁淤積誘導(dǎo)的肝纖維化。Pan 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A 通過抑制成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來緩解肺纖維化。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A能夠改善野百合誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，模型組血清中肌鈣蛋白T 和CK-MB水平明顯升高，而丹酚酸A組血清中肌鈣蛋白T和CK-MB水平較模型組顯著降低。此外，模型組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)升高，丹酚酸A組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)較模型組顯著降低，說明丹酚酸A能夠減輕心肌梗死大鼠心肌損傷和心肌纖維化。另有研究表明，過度的心肌纖維化能夠?qū)е滦墓δ墚惓25-27]。因此，本研究檢測(cè)大鼠心功能和血清中NTproBNP 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明顯升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低；丹酚酸A 組大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明顯降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯升高，這些結(jié)果表明丹酚酸A能有效改善心肌梗死大鼠的心功能。

心肌梗死時(shí)TGF-β1 被激活，繼而與TGF-β 受體結(jié)合，使得下游轉(zhuǎn)錄因子Smad 活化，進(jìn)而促進(jìn)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等纖維化基因的表達(dá)，導(dǎo)致過度的膠原沉積在心肌間質(zhì)，最終出現(xiàn)心肌纖維化[28-29]。Dai等[30]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A 能夠下調(diào)TGF-β1 表達(dá)，抑制Smad2激活，進(jìn)一步減輕檳榔提取物誘導(dǎo)的口腔黏膜下纖維化。為進(jìn)一步研究丹酚酸A 抑制心肌梗死大鼠心肌重構(gòu)的潛在機(jī)制，本組檢測(cè)了TGFβ1/Smad 信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，模型組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)明顯升高，與模型組比較，丹酚酸A 組TGF-β1 和p-Smad2 蛋白明顯降低，說明丹酚酸A能夠抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路。

綜上所述，丹酚酸A 能夠改善心肌梗死大鼠心肌纖維化，進(jìn)而改善心功能，該作用可能與抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路有關(guān)。