劉 哲，李丹妮，王 宇，王 濤，王 萌，馮 淑

（延安市食品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西延安 716000）

大腸菌群是指一類在一定培養(yǎng)條件下能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]。濕式大腸菌群快檢紙片是近年來新出現(xiàn)的可用于餐（飲）具或公共場所用品用具大腸菌群檢測的快檢產(chǎn)品，該類產(chǎn)品具有攜帶方便、操作簡單等特點，且相較于干式快檢紙片省去了使用無菌生理鹽水潤濕紙片的環(huán)節(jié)，從而降低了檢測操作和環(huán)境污染的風(fēng)險[2]。

近年來，隨著各類快檢產(chǎn)品出現(xiàn)的越來越多，各產(chǎn)品的質(zhì)量也參差不齊[3-4]，產(chǎn)品使用單位或個人對所購買產(chǎn)品的性能缺乏有效了解。本文將著重探索對濕式大腸菌群快檢紙片的性能進行分析、驗證的一般流程，為產(chǎn)品使用單位或個人選用和驗收、驗證該類大腸菌群快檢產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

環(huán)境樣本（自然環(huán)境、居住、辦公環(huán)境等）、人工污染樣本。濕式大腸菌群快檢紙片、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、無菌接種環(huán)、無菌移液管、無菌平皿等。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）、產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048）、福氏志賀氏菌（CICC 21534）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、糞腸球菌（ATCC 29212）和金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜、冰箱（2～8 ℃）、培養(yǎng)箱（36±1）℃、渦旋振蕩器、移液槍等。

1.3 方法

本文將著重對紙片的污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)、檢出水平（LODX）、檢測結(jié)果有效性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性驗證等方面進行試驗分析。

1.3.1 污染指標(biāo)

選取2～4 個不同批號（本次試驗為4 個批號：200605、200903、210505 和210506）的濕式大腸菌群快檢紙片產(chǎn)品，無菌操作，每個批號分別取5 張快檢紙片，裝入紙片配套的無菌小袋中，置（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

1.3.2 特異性指標(biāo)

本文綜合濕式大腸菌群快檢紙片自身的產(chǎn)品質(zhì)量要求和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）中對大腸菌群相關(guān)培養(yǎng)基、試劑的質(zhì)量要求，確定使用大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌等7 種菌對紙片進行大腸菌群的特異性驗證。

驗證時，用無菌接種環(huán)從上述7 種菌的新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面上沾取一環(huán)菌，直接于紙片表面劃線，然后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察各菌在紙片上的特異形態(tài)。本文試驗中選取了4 個不同批號（同1.3.1）的紙片進行特異性驗證。

1.3.3 檢出水平（LODX）

本文通過紙片對高、中、低3 個接種水平和空白的樣本勻液的測試結(jié)果來獲得該紙片法的檢出水平（由于測試的樣品數(shù)量較少，本文中使用“估計LOD50”[5]），高、中、低3 個接種水平和空白分別做2 個測試，共獲得8 個結(jié)果。記錄每個接種水平獲得的陽性結(jié)果（檢出）數(shù)量，使用《微生物檢測方法確認(rèn)與驗證指南》（RB/T 033—2020）附錄B 中的表B.1 確定估計LOD50。

高水平接種量為不超過預(yù)期LOD50（預(yù)期的LOD50設(shè)定為：≤3 CFU/測試單元[5]）的10 倍，中水平接種量可由高水平接種物稀釋2 倍獲得，低水平接種量可由高水平接種物稀釋10 倍獲得。

用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）制備濃度（單位：CFU/mL）分別為高、中、低接種水平10 倍的接種物勻液。測試時，無菌操作，先取適量濕式大腸菌群快檢紙片置于配套的無菌袋中，然后分別吸取0.1 mL（測試單元）各接種水平的接種物勻液和空白液，均勻滴加（接種）于紙片表面，每個接種水平和空白分別測試2 張紙片，滴加（接種）完成后，將紙片置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。同時，分別吸取0.1 mL 各水平接種物勻液和空白液加入2 個無菌平皿，立即倒入15～20 mL 冷卻至46 ℃的營養(yǎng)瓊脂，搖勻，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)，對各接種水平的接種物勻液濃度和空白對照進行同步確認(rèn)。觀察并記錄測試結(jié)果。

1.3.4 檢測結(jié)果有效性

本文試驗中，為覆蓋更廣泛的微生物種類，用濕式大腸菌群快檢紙片對采集的21 個自然環(huán)境（土壤、河流、小溪等）樣本、30 個居住環(huán)境（廚房、餐廳、衛(wèi)生間和臥室等）樣本和20 個辦公環(huán)境（辦公室、走廊、電梯間、公共衛(wèi)生間等）樣本，共計71 個環(huán)境微生物樣本進行檢測，然后將所有的檢測結(jié)果用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 消毒餐（飲）具》（GB 14934—2016）中的附錄B B.1 發(fā)酵法進行確認(rèn)，從而對紙片的檢測結(jié)果有效性進行驗證。

操作時，環(huán)境表面的微生物樣本直接用紙片進行采集，土壤、河流等不適合直接采集微生物的樣本，加無菌生理鹽水振蕩提取其中的微生物后，取適量提取液置營養(yǎng)肉湯（NB）中培養(yǎng)過夜，再取樣本培養(yǎng)液劃線接種于紙片，（36±1）℃培養(yǎng)18 h，記錄檢測結(jié)果。液體樣本直接取適量樣本勻液經(jīng)肉湯增菌后，取增菌液劃線接種于紙片。

無菌操作，將培養(yǎng)后的紙片全部分別轉(zhuǎn)移至LST肉湯管，置培養(yǎng)箱中（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，進行發(fā)酵試驗。后續(xù)復(fù)發(fā)酵試驗和結(jié)果判定按GB 14934—2016 附錄B B.1 發(fā)酵法中的要求進行。觀察并記錄測試結(jié)果。

1.3.5 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性

同一生產(chǎn)批號的紙片可通過在常規(guī)條件下保存3～6 個月以上后再次進行污染指標(biāo)和特異性指標(biāo)的驗證來分析該紙片在產(chǎn)品有效期內(nèi)的質(zhì)量穩(wěn)定性，本次試驗選取已于常規(guī)保存條件下保存11 個月的濕式大腸菌群快檢紙片（生產(chǎn)批號：200605）進行驗證。不同生產(chǎn)批號紙片質(zhì)量的持續(xù)穩(wěn)定性由1.3.1～1.3.3 的試驗中，同時或先后選取2～4 個不同批號的紙片進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 污染指標(biāo)

試驗中4 個不同批號的紙片經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)18 h 后，均無變化，保持初始的狀態(tài)和顏色（濕潤、平整，紫色）。表明在無菌操作及規(guī)定的培養(yǎng)條件下，紙片和配套的無菌塑料小袋自身不會出現(xiàn)污染而干擾大腸菌群檢測。

2.2 特異性指標(biāo)

試驗結(jié)果顯示，3 種大腸菌群（大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）在紙片上生長旺盛，且呈現(xiàn)典型的陽性反應(yīng)，即紙片上可見點、線狀紅色斑點或片狀紅暈，斑點周圍變黃或明顯變黃。其他4 種菌中，鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌呈陰性反應(yīng)，即紙片上可見點、線狀紅色斑點或片狀紅暈，但斑點或紅暈周圍顏色不變。另外2 種革蘭氏陽性菌處于被抑制狀態(tài)，只可見少量紅色斑點或紅暈且斑點或紅暈周圍不變色，呈陰性反應(yīng)，且各菌在不同批號紙片上的特異形態(tài)無明顯區(qū)別。說明本次試驗中該紙片對大腸菌群和非大腸菌群細(xì)菌可呈現(xiàn)明顯的特異性反應(yīng)，且對革蘭氏陽性菌有一定抑制作用。

2.3 檢出水平（LODX）

檢出水平的測試結(jié)果見表1。結(jié)果表明，紙片在樣品（接種物勻液）處于低污染水平時，即測試單元（0.1 mL 樣液）中的目標(biāo)微生物數(shù)為1CFU(（0+2）/2=1)時，即有50%的概率檢出該菌（2 張測試紙片中有1 張檢出（陽性））。在高污染水平和中污染水平時2 張紙片均檢出。且2 個批號的紙片測試結(jié)果一致。查RB/T 033—2020 附錄B 表B.1，得估計LOD50（CFU/測試單元）=1 CFU/測試單元。測試結(jié)果間接表明該紙片的性能符合預(yù)期。

表1 濕式大腸菌群快檢紙片檢出水平的測試結(jié)果

2.4 檢測結(jié)果有效性

樣本的紙片檢測結(jié)果及發(fā)酵法對紙片檢測結(jié)果的驗證見表2。結(jié)果表明，在本次試驗中，該紙片的檢測結(jié)果與發(fā)酵法的驗證結(jié)果一致，說明對采集到的同一樣本，其與發(fā)酵法的檢測結(jié)果一致，表明該紙片顯示的檢測結(jié)果與發(fā)酵法結(jié)果同等可靠有效。

表2 環(huán)境樣本的紙片檢測結(jié)果及發(fā)酵法對紙片檢測結(jié)果的驗證

2.5 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性

同一批號（200605）的紙片在常規(guī)條件下保存11 個月之后，其污染指標(biāo)和特異性指標(biāo)試驗結(jié)果未發(fā)生變化。不同批號的紙片，其污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)和檢出水平的測試結(jié)果一致（參見2.1～2.3）。

結(jié)果表明該紙片不論是同一批號產(chǎn)品在有效期內(nèi)的質(zhì)量穩(wěn)定性，還是不同批號產(chǎn)品質(zhì)量的持續(xù)穩(wěn)定性均符合預(yù)期。

3 結(jié)論

本文對選取或設(shè)定的濕式大腸菌群快檢紙片的污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)、檢出水平（LODX）、檢測結(jié)果有效性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性等5 項性能指標(biāo)進行了較為詳細(xì)的試驗分析，證明該紙片性能穩(wěn)定可靠，符合要求和預(yù)期的同時，也表明本文所探索的對濕式大腸菌群快檢紙片性能進行分析驗證的一般流程可有效的對該類紙片產(chǎn)品進行較為全面的性能驗證，在使用該類快檢產(chǎn)品時可作為產(chǎn)品選用和驗收、驗證的參考。