盧 瑛

（萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東萊蕪 271100）

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain,EC 3.4.22.67）是存在于生姜塊狀根莖中的一種巰基蛋白酶，有兩種GP-I 和GP-II（GPI 和GPII 分別與GenBank 中GP3 和GP2 同源性較高），均含有221 個(gè)氨基酸，含有6 個(gè)Cys 形成3 個(gè)二硫鍵為糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能夠水解膠原蛋白，可用于肉類嫩化、酒類澄清，乳制品凝固等［1］，以姜汁為添加劑開發(fā)的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在廣東地區(qū)頗受歡迎，因此該酶具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景［2］。

生姜蛋白酶的分離純化工藝操作復(fù)雜，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品種、不同栽培地區(qū)及不同氣候條件下差異非常大，甚至同一品種的干姜與生姜之間的含量也不相同，導(dǎo)致生姜蛋白酶的提取率不穩(wěn)定［3］。尤其生姜常年連作導(dǎo)致莖腐病、斑點(diǎn)病和姜瘟病高發(fā)，推升了市場上生姜的價(jià)格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，進(jìn)一步限制了生姜蛋白酶的開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)從萊蕪生姜中提取總RNA，通過RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增生姜蛋白酶基因，并構(gòu)建了pET-GPII 原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21 中實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá)，為生姜蛋白酶工程化生產(chǎn)進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和植物材料

大腸桿菌DHB4 和宿主菌BL21 以及質(zhì)粒pET30a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存，萊蕪生姜購于萊蕪大潤發(fā)超市。

1.1.2 酶、試劑盒和生化試劑

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA 聚合酶、TransStart FastPfu DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；植物總RNA 提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司；T4 DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶KpnI、XbaI、EcoRI 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit 購自ThermoFisher 公司；DNA 凝膠回收試劑盒和DNA 質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MGEA 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生姜蛋白酶cDNA 的合成

根據(jù)植物總RNA 提取試劑盒操作說明分離提取生姜總RNA，將RNA 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 并稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank（NCBI）數(shù)據(jù)庫中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI:57118005）和GP3a（GI:57118009）的上下游序列設(shè)計(jì)特異性引物，以生姜mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，PCR 克隆生姜蛋白酶基因。兩對特異性引物，分別為GP2a 上游引物：5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTA GACAAT-3’，下游引物：5’-ATTAAAGCTTTGCACTGC TCTTGAGACCTCC-3’；GP3a 上游引物：5’-ATTTGGAT CCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’，下游引物：5’-ATTAG TCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’；GPII 上游引物：5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’，下游引物：5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCT CC-3’。

1.2.3 生姜蛋白酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以稀釋后的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增生姜蛋白酶基因。PCR 反應(yīng)程序按照TransStart FastPfu DNA 聚合酶說明書執(zhí)行。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。將回收的PCR 產(chǎn)物交由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，并與Gene Bank 上已發(fā)布的序列進(jìn)行比對。以GP2 序列為模板克隆GPII 片段，并連接到表達(dá)載體pET30a（+）載體上轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHB4，經(jīng)Kan+抗性的LB 固體培養(yǎng)基篩選。挑取抗性重組子測序，將序列正確的克隆命名為pETGPII。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 生姜蛋白酶表達(dá)條件優(yōu)化

將攜帶重組表達(dá)載體pET-GPII 的工程菌BL21 在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD600為0.4 時(shí)，分別加入0～0.5 mmol/L 不同濃度的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h，并通過SDS 電泳分析IPTG濃度對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。進(jìn)一步在加入0.1 mmol/L 的IPTG條件下誘導(dǎo)0～10 h 不等的時(shí)間，分析不同誘導(dǎo)時(shí)間對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜蛋白酶基因的克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過RT-PCR 成功獲得與目的基因大小相符的DNA 片段。將該片段連接到原核表達(dá)載體pET-30a（+）并進(jìn)行測序，GP2 序列全長為1 146 bp，GP3 為1 401 bp。序列比對發(fā)現(xiàn)與GP2 與GP2b（GI:57118006）同源性為99.91%，僅在945 位堿基發(fā)生改變，與GP2a（GI:57118005）相同位置的堿基一致。GP3 與GP3b（GI:57118011）同源性為94.77%，有451、700 和804 這3 個(gè)位置的堿基發(fā)生改變，與GP3a（GI:57118009）相同位置上的堿基一樣（如圖1 所示），說明了不同品種生姜蛋白酶基因的多樣性。進(jìn)一步以GP2 為模板，克隆出了726 bp 的GPII 片段［4］，并將其連接到原核表達(dá)載體pET-30a（+）構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-GPII。

圖1 生姜蛋白酶基因序列

2.2 生姜蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將重組表達(dá)載體pET-GPII 轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，培養(yǎng)單克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，濃度為0.05 mmol/L，發(fā)酵1 h，4 h，6 h 和10 h，以未添加IPTG 的pET-GPII 的菌和轉(zhuǎn)化空載體的菌為對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到6 h 以后，目的基因的蛋白表達(dá)量沒有顯著變化（圖2A）。當(dāng)加入不同濃度的IPTG 時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量最多（圖2B）；因此推斷最佳誘導(dǎo)條件為37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG 誘導(dǎo)6 h。

圖2 SDS-PAGE 檢測生姜蛋白酶的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

近年來隨著對生姜蛋白酶的深入研究，發(fā)現(xiàn)生姜蛋白酶對肉類具有良好的嫩化作用，對于酒類的澄清效率遠(yuǎn)高于木瓜蛋白酶，還可作為凝乳劑來制作風(fēng)味乳品。用生姜蛋白酶制備的奶酪，口感好，無苦澀感［5-6］，說明生姜蛋白酶具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰，細(xì)胞生長周期短，增殖速度快，發(fā)酵產(chǎn)量高，易于工程化等優(yōu)點(diǎn)而受到歡迎，而且優(yōu)化發(fā)酵條件可以使目的蛋白以可溶的形式生產(chǎn)。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá)，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下表達(dá)6 h 產(chǎn)量最高。這為生姜蛋白酶工程化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。