李 圓， 何偉麗， 王寧霞， 曲少華

（暨南大學附屬第一醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州 510630）

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，2020 年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226 萬例，超過了肺癌成為全球第一大腫瘤，嚴重威脅著女性健康［1］。乳腺癌是高度異質(zhì)性的疾病，第2 代測序技術(shù)證實，在93 個編碼蛋白質(zhì)的乳腺癌基因中攜帶可能的驅(qū)動突變［2］。因此，現(xiàn)行的基于乳腺癌臨床病理特征以及雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達制定綜合方案，并非適用于所有的乳腺癌患者。傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)和人源性腫瘤異種移植模型為乳腺癌的研究探索提供了大量的材料，但由于實驗技術(shù)缺陷、培養(yǎng)周期長等因素難以滿足深入的研究要求。因此，建立一種能夠準確模擬人體腫瘤特征的實驗?zāi)Ｐ统蔀槠惹行枰?。近年來，通過優(yōu)化各種培養(yǎng)條件建立的乳腺癌類器官模型，由于其取材方便、培養(yǎng)周期短和遺傳穩(wěn)定等特點，能夠最大程度的還原乳腺癌細胞在體內(nèi)的組織和分子特性，重現(xiàn)部分乳腺功能［3］，有望在乳腺癌發(fā)病機制研究、個體化治療、新藥開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

1 類器官技術(shù)

1.1 類器官的概念 為了探索能夠模擬體內(nèi)環(huán)境的三維培養(yǎng)模型，Clevers 等［4］通過對小腸干細胞的分離培養(yǎng)，成功建立了腸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。該研究顯示，單個干細胞能以自組織形式構(gòu)建腸道隱窩絨毛結(jié)構(gòu)，干細胞周圍的微環(huán)境則形成干細胞龕（stem cell niche）。干細胞龕是腫瘤微環(huán)境的組成部分，其主要包含成纖維細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、細胞因子、生長因子、細胞外基質(zhì)等。在干細胞龕中，干細胞可通過細胞-細胞直接或間接接觸形式進行自我更新、調(diào)控自身增殖和分化［5］。類器官即是在特定培養(yǎng)條件下對干細胞龕的構(gòu)建。正常組織或腫瘤組織來源的干細胞在受到體外提供的細胞因子或生長因子的刺激下，重建干細胞龕，形成具有自組織能力的三維結(jié)構(gòu)，即類器官。類器官既能重現(xiàn)來源組織的結(jié)構(gòu)和功能［6］，又能模擬體內(nèi)組織的原始生物學特性，成為二維細胞培養(yǎng)、人源性腫瘤異種移植模型和器官組織切片模型以外的第4 種臨床前模型，兼具前三者優(yōu)點，在腫瘤研究中具有廣泛的應(yīng)用價值［7］。目前，類器官技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域，包括干細胞模型、腫瘤研究模型、個體化治療模型和新藥開發(fā)臨床前模型等多個研究領(lǐng)域已取得研究進展。

1.2 乳腺癌類器官培養(yǎng)的進展 DeRose 等［8］于2013年將乳腺癌組織樣本通過機械破壞和酶消化相結(jié)合的方法，制定出首個乳腺癌患者來源的類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)方案。實驗結(jié)果表明，不同來源的腫瘤組織所需的消化時間各不相同，患者來源的腫瘤組織消化至少過夜，小鼠移植來源的腫瘤組織所需的消化時間則可適當縮短。為了提高類器官培養(yǎng)成功率，研究人員繼續(xù)在培養(yǎng)條件上進行優(yōu)化探索。Zubeldia-Plazaola 等［9］觀察到，在酶濃度較低的情況下延長消化時間，培養(yǎng)形成類器官的成功率更高。Samanth 等［10］在膠質(zhì)母細胞瘤的干細胞培養(yǎng)基中添加特異性ROCK 蛋白抑制劑Y-27632或法舒地爾，提高了干細胞的體外存活和增殖能力，降低了類器官在接種到新的培養(yǎng)基后失巢凋亡的發(fā)生率，證實ROCK 蛋白抑制劑可以優(yōu)化腫瘤干細胞培養(yǎng)基。隨后，Sachs 等［11］對乳腺癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)方案再次進行了優(yōu)化。研究人員將患者來源的乳腺癌細胞接種在細胞外基質(zhì)Matrigel 上，檢測添加不同因子對構(gòu)建類器官的影響。結(jié)果顯示，添加絲裂原神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，Nrg1）能有效促進乳腺癌類器官的形成與傳代，證實Nrg1 可能是乳腺癌類器官培養(yǎng)基的一個重要補充因子；添加濃度高于5 ng/mL 的表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能促乳腺癌上皮細胞增殖，但也會使乳腺癌類器官逐漸沉降于Matrigel 中導致其三維結(jié)構(gòu)消失。Wnt-3A 作為一種包含328 個氨基酸殘基的單鏈蛋白質(zhì)，可在維持干細胞龕上起關(guān)鍵作用，但添加Wnt-3A 并未對類器官的培養(yǎng)條件起到改善作用；MAPK 抑制劑SB202190 可促進多能干細胞穩(wěn)定性，但其添加濃度高于1 mmol/L 也會降低類器官的形成效率。至此，Sachs 等［11］建立了乳腺癌類器官生物庫，含有超過100個乳腺原位癌和轉(zhuǎn)移癌的類器官系，為開展乳腺癌類器官研究提供了依據(jù)。

2 乳腺癌研究模型

2.1 二維細胞系模型 傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)是指在體外人工模擬體內(nèi)環(huán)境，使單個細胞或細胞群在二維平面生存、增殖、傳代等的細胞培養(yǎng)技術(shù)。目前，乳腺癌研究領(lǐng)域已有超過50 種不同的二維細胞系，其構(gòu)建簡單、經(jīng)濟并可進行高通量藥物篩選，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的基礎(chǔ)研究和藥物敏感性等研究［12］。但二維細胞系分化來源于單個細胞，缺乏腫瘤細胞的異質(zhì)性以及腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用［13］，存在生物穩(wěn)定性差、可能出現(xiàn)優(yōu)勢細胞克隆而致潛在的基因突變等缺點，無法良好地重現(xiàn)腫瘤組織的多樣性［14］，由此也引發(fā)了二維細胞系是否能夠精準代表不同類型乳腺癌的思考。

2.2 人源性腫瘤異種移植模型 人源性腫瘤異種移植是將腫瘤細胞或組織通過原位移植或皮下移植到免疫缺陷動物（通常為免疫缺陷小鼠）體內(nèi)，進而實現(xiàn)腫瘤細胞的生長增殖［15］。該體內(nèi)模型可實現(xiàn)腫瘤細胞或組織的血管生成，相對接近真實的人體腫瘤內(nèi)環(huán)境，可對患者的特異性療效反應(yīng)進行模擬。此外，該模型還能在一定程度上重現(xiàn)患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，反映腫瘤異質(zhì)性和生物學穩(wěn)定性。相比二維細胞系，人源性腫瘤異種移植模型雖在模擬腫瘤微環(huán)境方面有獨特優(yōu)勢，但由于其培養(yǎng)周期長、費用高、動物應(yīng)激反應(yīng)等特點，其定量數(shù)據(jù)獲取困難，難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床試驗。此外，腫瘤發(fā)生在人體內(nèi)和動物體內(nèi)存在的組織學和基因組學異質(zhì)性也是該模型不適用于高通量藥物篩選的原因之一［16］。

2.3 器官組織切片模型 器官組織切片模型在許多方面平衡了二維細胞系模型和人源性異種移植模型的優(yōu)點和缺陷。不同厚度的器官組織切片，可以在適當條件下保存數(shù)周至數(shù)月。與人源性腫瘤異種移植模型相似，器官組織切片模型能在短時期內(nèi)維持基本的組織病理學結(jié)構(gòu)，可用于精確的藥物篩選［17］，同時也可實現(xiàn)更加個體化的患者療效評估。相比二維細胞系模型，器官組織切片模型難以長期保存［18］，無法反映腫瘤干細胞的潛能，因此，僅能體現(xiàn)部分腫瘤組織特性［19］。

2.4 類器官模型 類器官技術(shù)的發(fā)展，可在一定程度上彌補上述傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的缺陷。目前，類器官培養(yǎng)技術(shù)已成功應(yīng)用于胃癌［20］、結(jié)直腸癌［21］、肺癌［22］、前列腺癌［23］等腫瘤研究。培養(yǎng)類器官模型所需的基質(zhì)膠大多數(shù)來源于小鼠肉瘤，這種在室溫條件下可聚合的具有生物學活性的三維基質(zhì)，主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白（nidogen）和硫酸肝素糖蛋白，以及生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，可用于模擬體內(nèi)細胞基底膜的結(jié)構(gòu)組成、物理特性和生物功能，有利于細胞的體外分化及培養(yǎng)。另有Kim 等［24］觀察到，EGF、堿性成纖維細胞生長因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、地塞米松、WNT 激活劑等在類器官模型培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用。與其他模型相比，類器官模型標本可以來源于手術(shù)或穿刺活檢，靈活便捷，還能在培養(yǎng)過程中維持基因組穩(wěn)定性，重現(xiàn)原始腫瘤的異質(zhì)性［25］，可用于研究細胞與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用特點。此外，類器官培養(yǎng)周期較短，1～2 周即可進行傳代［19］，時效性強，可操作性高，能夠?qū)崿F(xiàn)二維細胞系模型和人源性腫瘤異種移植模型無法進行的高通量藥物篩選，同時也降低了動物實驗所涉及到的倫理風險，在腫瘤研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景［26］。

3 乳腺癌類器官在轉(zhuǎn)化醫(yī)學中的應(yīng)用

3.1 乳腺癌類器官生物庫 基于基因組學、病理學和組織學特征上的差異，乳腺癌被劃分為多個不同的亞型。Sachs 等［11］對乳腺癌組織和乳腺癌類器官的HE染色切片進行組織學分析，結(jié)果顯示大部分乳腺癌類器官的形態(tài)與原始腫瘤的組織病理學特征、激素受體以及HER2 受體的表達水平相匹配；對乳腺癌類器官的全基因組DNA 測序結(jié)果進行拷貝數(shù)變異和體細胞突變等分析，證實乳腺癌類器官能囊括乳腺癌的基因組學多樣性，包括拷貝數(shù)變異、癌基因突變以及突變特點等；結(jié)合超過1 100 個來自TCGA 的乳腺癌數(shù)據(jù)庫，以及基于超過25 000個基因所構(gòu)建的相關(guān)熱圖，對22 個乳腺癌類器官進行RNA測序分析，證實乳腺癌類器官能涵蓋主要的乳腺癌亞型且在數(shù)據(jù)庫中隨機分布。因此，乳腺癌類器官在一定程度上能反映人體乳腺癌的組織學和遺傳學異質(zhì)性，在培養(yǎng)過程中能夠維持基因組穩(wěn)定性，適用于高通量藥物篩選，豐富了新藥開發(fā)的實驗材料來源。對于研究人員而言，乳腺癌類器官生物庫的建立，可以減少實驗標本取材的繁瑣流程，降低倫理風險，為乳腺癌研究提供可靠模型。對于患者而言，乳腺癌類器官生物庫若能取代新藥研發(fā)的前期臨床試驗，將為乳腺癌患者實現(xiàn)個體化治療帶來希望。

3.2 模擬乳腺癌的發(fā)生與進展 類器官模型最大的潛能之一是探索疾病發(fā)生發(fā)展的機制研究。為了模擬乳腺癌的發(fā)生，Dekkers 等［27］將正常乳腺上皮組織培養(yǎng)形成乳腺類器官，隨后借助CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)靶向敲除了4 個與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因p53、PTEN、RB1和NF1，使乳腺類器官轉(zhuǎn)變?yōu)槿橄侔╊惼鞴俨@得在體外長期生存的能力。將通過該方法構(gòu)建的乳腺癌類器官移植到小鼠中，評估單基因突變的致瘤能力，結(jié)果顯示在移植瘤中，有1/6出現(xiàn)了p53、PTEN和RB1突變，有1/2 出現(xiàn)了p53、PTEN、RB1和NF1突變，且均對內(nèi)分泌治療和化療敏感，由此揭示了乳腺癌發(fā)生的分子機制。同樣，Drost等［28］利用CRISPR-Cas9技術(shù)對正常腸道類器官中的APC、p53、KRAS和SMAD4等與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的基因進行靶向修飾，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)直腸癌類器官，并構(gòu)建異植瘤模型，觀察到腫瘤可以表現(xiàn)出浸潤性生長的特征。類器官模型結(jié)合CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)，不僅可以模擬腫瘤的發(fā)生發(fā)展，揭示腫瘤的形成機制，未來或還可以通過CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)引入或刪除基因片段，達到抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞增殖的目的，實現(xiàn)腫瘤的基因治療［29］。

3.3 抗腫瘤藥物篩選 盡管二維細胞系模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物篩查試驗，但由于其不足以反映原始腫瘤特征，以致臨床試驗中新藥的研發(fā)困難。越來越多的研究顯示，類器官模型在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌、肝癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤疾病中具有良好的應(yīng)用前景［14］。其中，在乳腺癌類器官生物庫中進行的小規(guī)模藥物篩選試驗已取得可喜成果。Sachs等［11］通過檢測HER2過表達的乳腺癌類器官對抗HER2 靶向藥物（如阿法替尼、吉非替尼等）的敏感性，證實類器官對抗HER2 靶向藥物敏感。同樣，BRCA1突變的乳腺癌類器官對PARP 抑制劑（如奧拉帕尼、尼拉帕尼等）治療敏感。該研究在一定程度上證實乳腺癌類器官可用于乳腺癌的藥物敏感性的檢測。Vlachogiannis 等［26］針對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌類器官進行了臨床常用藥物和臨床試驗藥物的敏感性檢測，在評估患者的療效反應(yīng)后報道了88%的陽性預(yù)測值和100%的陰性預(yù)測值，也證實了類器官在抗腫瘤藥物篩選方面的應(yīng)用價值。此外，將類器官模型的藥敏檢測結(jié)果和基因檢測結(jié)果結(jié)合分析，還能獲得針對患者個體有效的藥物信息，從而指導臨床用藥，實現(xiàn)個體化治療；如果培養(yǎng)患者的正常組織類器官并給予抗腫瘤藥物處理，還能檢測該藥物對患者正常組織的毒性，從而權(quán)衡藥物療效，制定最佳治療方案。

3.4 藥物療效和毒性評估 乳腺癌類器官具有模擬腫瘤微環(huán)境的優(yōu)勢，可用于藥物療效和毒性評估。在藥物療效方面，Walsh 等［30］通過光學代謝成像（optical metabolic imaging，OMI）量化NADH 和FAD 在6個不同的原始乳腺癌樣本中的熒光強度和半衰期，評估乳腺癌類器官對于抗腫瘤藥物如紫杉醇、抗HER2 抗體曲妥珠單抗、IP3 途徑抑制劑XL147 的單藥及其聯(lián)合用藥的藥物敏感性，在臨床中證實了曲妥珠單抗的使用不會改變OMI 指數(shù)，也不會改變紫杉醇和他莫昔芬的療效反應(yīng)。在藥物毒性評估方面，研究人員利用細胞與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用原理以及生物化學和力學特性，結(jié)合微流控技術(shù)構(gòu)建了乳腺癌類器官的微芯片培養(yǎng)方案。該研究表明，雖然三維細胞培養(yǎng)的生長速度較二維培養(yǎng)緩慢，但應(yīng)用微芯片培養(yǎng)的方法檢測不同的抗癌藥物如絲裂霉素和5-氟尿嘧啶的細胞毒性結(jié)果與傳統(tǒng)的MTT法同樣有效。亦有用惡性腫瘤患者外周血和腹水提純的腫瘤細胞成功建立的類器官的報道［31］，為晚期乳腺癌患者化療敏感藥物篩選及藥物療效評估提供了可能。

3.5 過繼細胞免疫治療（adoptive cell immunotherapy，ACT） 隨著單一藥物靶向治療耐藥問題的出現(xiàn)，利用患者自身的免疫系統(tǒng)，結(jié)合類器官與淋巴細胞體外共培養(yǎng)的ACT被認為是降低單藥耐藥風險的有效策略［32］。ACT 是指通過提供良好的微環(huán)境，調(diào)控抗腫瘤淋巴細胞的體外擴增，保證其重新輸注到患者體內(nèi)后持續(xù)增殖并發(fā)揮抗癌效應(yīng)的一種個體化癌癥療法［33］。目前，已有利用類器官模型和患者自身的免疫系統(tǒng)進行腫瘤治療的相關(guān)研究報道。Zumwalde 等［34］報道，氨基雙膦酸鹽（aminobisphosphonate）能夠促進來源于正常乳腺組織類器官的γδT淋巴細胞擴增，而γδT淋巴細胞能夠分泌抗腫瘤細胞因子IFNγ，從而有效地殺死三陰性乳腺癌細胞。Nozaki 等［35］檢測到，在培養(yǎng)基中加入IL-2、IL-7 和IL-15 后，小鼠腸道類器官的上皮內(nèi)淋巴細胞可在體外存活擴增并維持其功能超過數(shù)周，由此優(yōu)化了對類器官與淋巴細胞的共培養(yǎng)條件。近年來，乳腺癌免疫治療取得巨大進步，特別是給晚期三陰性乳腺癌患者帶來生存獲益。但目前乳腺癌免疫治療尚缺乏準確預(yù)測療效和預(yù)后的標記物。將類器官技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的免疫治療，不僅可以檢測免疫抑制劑（如PD-1和PD-L1抗體）療效，還能預(yù)測免疫治療的反應(yīng)，為實現(xiàn)個體化免疫治療帶來希望［36］。此外，胸腺類器官平臺的建立還可能為腫瘤特異性T 細胞的有效擴增研究出一個更加符合生理的體外環(huán)境［37］，類器官模型在乳腺癌免疫治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 限制與展望

盡管類器官在乳腺癌的腫瘤建模、發(fā)生發(fā)展機制、藥物篩選等基礎(chǔ)研究方面都能發(fā)揮重要作用，但其在乳腺癌的臨床轉(zhuǎn)化方面仍存在多方面的限制。首先，與傳統(tǒng)腫瘤研究模型相比，乳腺癌類器官的培養(yǎng)條件尚不成熟，建立乳腺癌類器官的成功率遠低于80%，其培養(yǎng)方案仍有待進一步優(yōu)化［38］；其次是可重復(fù)性欠佳，即使在相同的培養(yǎng)條件下，同一來源的組織也并不能培養(yǎng)出表征完全相同的乳腺癌類器官。解決以上難題，是乳腺癌類器官模型臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵，仍需深入研究［39］。此外，乳腺癌類器官缺乏血管化的過程，而新生血管、基質(zhì)以及免疫細胞等構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境對腫瘤的治療效果至關(guān)重要［19］，因此限制了乳腺癌類器官的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。目前，建立免疫細胞參與的類器官共培養(yǎng)體系已成趨勢，該體系模擬腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用，模擬更加真實的人體內(nèi)腫瘤生長環(huán)境，使乳腺癌類器官成為更加精準的體外腫瘤研究模型。

綜上所述，利用乳腺癌患者的腫瘤組織提取腫瘤干細胞培養(yǎng)成乳腺癌類器官，應(yīng)用于腫瘤建模、腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、藥物篩選方面等的基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化研究，是乳腺癌類器官作為臨床前研究模型的獨特優(yōu)勢。建立成熟的乳腺癌類器官平臺，使實現(xiàn)乳腺癌患者的個體化治療成為可能，將是未來類器官技術(shù)的研究熱點。