陳 鳳， 吳英杰， 秦應(yīng)和

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

Eph（erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma）互作交換蛋白（Eph-interacting exchange protein，Ephexin）是鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）家族的最大亞家族Dbl（diffuse B-cell lymphoma）的亞群之一，主要在Ephrin 配體與Eph受體介導(dǎo)的信號下激活，從而參與Rho蛋白的活性調(diào)節(jié)［1-2］。Rho 蛋白是一類分子大小為20～30 kD 左右的Ras 超家族成員之一，因其自身具有一段能將GTP 水解成GDP 的保守氨基酸序列，所以又叫Rho GTP 酶。RhoGEFs 是Rho 蛋白的三大調(diào)節(jié)因子之一，與Rho GTPase 活化蛋白（Rho GTPase-activating proteins，RhoGAPs）及Rho 鳥苷酸解離抑制因子（Rho guanine nucleotide dissociation inhibitors，RhoGDIs）共同控制非活性Rho-GDP 與活性Rho-GTP之間的動(dòng)態(tài)平衡，對細(xì)胞生長、遷移、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架形成、基因表達(dá)及病毒感染等生理生化活動(dòng)至關(guān)重要。目前為止，已經(jīng)確認(rèn)5個(gè)與Eph互作的交換蛋白，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時(shí)間先后順序分別命名為Ephexin1、Ephexin2、Ephexin3、Ephexin4 和Ephexin5，它們都是Rho、Ras 相關(guān)的C3 肉毒毒素底物1（Rasrelated C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）和細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，Cdc42）等常見Rho 蛋白的GEFs。Ephexins 的鳥苷酸交換活性失調(diào)及Rho 蛋白激活異常都可能導(dǎo)致癌癥等諸多疾病的發(fā)生，所以了解Ephexins 活性調(diào)控的分子機(jī)制及Ephrin/Eph 信號如何參與調(diào)控Rho 蛋白的活性對Ephexins調(diào)控相關(guān)疾病的治療至關(guān)重要。

1 Ephexins家族

1.1 Ephexins 的結(jié)構(gòu)與功能 Ephexins 家族的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為含有一個(gè)由200 個(gè)氨基酸組成的Dbl homology（DH）結(jié)構(gòu)域和與其串聯(lián)的Pleckstrin homology（PH）結(jié)構(gòu)域。除了Ephexin5 之外，其它Ephexins 家族成員還含有一個(gè)SH3 結(jié)構(gòu)域。Ephexins 的功能域在同源蛋白中高度保守，其中DH 域主要負(fù)責(zé)GEFs的鳥苷酸交換活性，并與相鄰PH 域形成鳥嘌呤核苷酸交換反應(yīng)的最小催化單元，DH 域的結(jié)構(gòu)阻遏量決定了Ephexins 和Rho 蛋白之間的偶聯(lián)特異性，因此，一些Ephexins 成員對Rho 蛋白的鳥苷酸交換活性具有特異性［3］。而PH 域則協(xié)同促進(jìn)Rho 蛋白的活化，介導(dǎo)GEFs的亞細(xì)胞定位［4］。SH3域可以通過分子內(nèi)或分子間的互作而調(diào)節(jié)含有該結(jié)構(gòu)域的GEFs 的活性［5］。除此之外，一些Ephexins家族成員的其他結(jié)構(gòu)域也可以通過分子內(nèi)互作阻礙其鳥苷酸交換活性，比如Ephexin4 的N20 結(jié)構(gòu)域（第234 和378 位氨基酸之間的區(qū)域），Ephexin3 的N 端螺旋結(jié)構(gòu)域（Helix）及Helix 和DH 域之間一段富含脯氨酸的基序（PxxP）等。雖然第一個(gè)Ephexin 被發(fā)現(xiàn)距今已20 余年，但Ephexins 在生理和病理環(huán)境中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制最近才被揭示。

1.2 Ephexins激活的分子機(jī)制

1.2.1 Ephrin/Eph 信號對Ephexins活性的調(diào)控 細(xì)胞內(nèi)的Ephexins 主要受Ephrin/Eph 信號調(diào)控。Eph受體是哺乳動(dòng)物基因組中最大的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，屬于跨膜RTK超家族?；谛蛄型葱约皩phrinA和EphrinB配體的親和性，Eph受體分為EphA和EphB兩種。通常情況下，EphA 與EphrinA 互作，EphB 與EphrinB 互作。然而也有一些例外，例如，EphrinB2 和EphrinB3可以與EphA4結(jié)合，EphrinA5可以與EphB2結(jié)合［6-8］。Ephrin/Eph互作提供了一種獨(dú)特的雙向信號機(jī)制，即Eph受體誘導(dǎo)的信號稱為正向信號，Ephrin配體啟動(dòng)的信號稱為反向信號，且正反向信號均可通過酪氨酸磷酸化依賴或非依賴轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。Ephexins 作為Eph 受體的直接下游蛋白，在Ephrin/Eph 介導(dǎo)下參與軸突導(dǎo)向、細(xì)胞遷移與凋亡、血管生成與血管平滑肌收縮等多種下游信號通路。目前為止，只有Ephexin2的Eph受體還未見報(bào)道［2］。

Ephexin1 在EphA4 的誘導(dǎo)下激活RhoA；缺失Ephexin1 影響小鼠出生后發(fā)育過程中突觸的成熟，從而導(dǎo)致成年小鼠神經(jīng)肌肉接頭處神經(jīng)傳遞受損與肌無力；Ephexin1 缺失引起的RhoA 活性降低是神經(jīng)肌肉接頭異常的主要原因［10］。在骨骼肌細(xì)胞中，EphrinA 與EphA4 結(jié)合誘導(dǎo)Ephexin1 的第87 位酪氨酸發(fā)生磷酸化，從而增強(qiáng)Ephexin1對RhoA 的鳥苷酸交換活性，但不改變其對Rac1 或Cdc42 的鳥苷酸交換活性［11］。Chang 等［12］首次通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Ephexin1 在雛雞和小鼠胚胎中指導(dǎo)脊髓外側(cè)運(yùn)動(dòng)柱的軸突導(dǎo)向，并提到Ephexin1 可能在EphB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮一定的作用。

Ephexin3 在EphA4 的誘導(dǎo)下主要激活RhoA，參與細(xì)胞遷移和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的調(diào)控［13-14］。Ephexin3與Ephexin1 的作用機(jī)制不同。在神經(jīng)肌肉接頭的早期發(fā)育中，Ephexin1 發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Ephexin3 的缺失雖然會(huì)導(dǎo)致RhoA 和Cdc42 的活性降低，但是不會(huì)影響神經(jīng)肌肉接頭的早期發(fā)育［14］。Wang 等［15］通過體外實(shí)驗(yàn)證明Ephexin3 還可以弱激活Rho 家族的其它成員RhoC 和RhoG，但具體生理功能還有待進(jìn)一步研究。

Ephexin4 在EphA2 的誘導(dǎo)下特異性激活RhoG，從而參與乳腺癌細(xì)胞遷移。EphA2 受體的第897 位絲氨酸磷酸化既可以增強(qiáng)其與Ephexin4 的結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移［16］，也可以招募RhoG 定位到細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞分裂M期的正常進(jìn)行［17-18］。

Ephexin5 的DH-PH 域酪氨酸在EphrinA/EphA4介導(dǎo)下發(fā)生磷酸化，磷酸化的Ephexin5 進(jìn)一步激活RhoA，從而參與血管平滑肌收縮相關(guān)的應(yīng)力纖維的形成［19］。正常生理狀態(tài)下，Ephexin5 與EphB2 結(jié)合抑制興奮性突觸的形成［20］。當(dāng)EphrinB 與EphB2 結(jié)合誘導(dǎo)Ephexin5 磷酸化，使其被泛素-蛋白連接酶E3A 泛素化并被蛋白酶體降解時(shí)，Ephexin5 對興奮性突觸形成的抑制效應(yīng)才被解除。另外，蛋白激酶C可以介導(dǎo)Ephexin5 的第107 和109 位絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，以非配體依賴形式激活RhoA 并參與調(diào)控神經(jīng)元樹突棘的形成［21］。上述研究結(jié)果表明，Ephexins通過Ephrin/Eph信號參與多種細(xì)胞事件。

1.2.2 Ephexins 自抑制狀態(tài)的調(diào)控 在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Ephexins 的鳥苷酸交換活性是受到抑制的，當(dāng)Ephexins 與Eph 結(jié)合才能誘導(dǎo)Rho 蛋白的激活。目前為止，研究者普遍認(rèn)為Ephexins 的自抑制狀態(tài)是Ephexins分子內(nèi)互作封閉其催化區(qū)域所致。

Ephexin1 與Ephexin3 的活性調(diào)控機(jī)制相似。Ephexin3 的活性受N 端Helix 區(qū)域與DH 域的互作影響。突變Helix 區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸或截短此段氨基酸序列都可以完全解除Ephexin3 的自抑制狀態(tài)。另外，Ephexin3 的第1 097 和1 100 位酪氨酸磷酸化也可以破壞其分子內(nèi)互作，使RhoA 與Ephexin3 的DH域結(jié)合并被激活［22］。He 等［23］發(fā)現(xiàn)，Ephexin3 的SH3域與PxxP 域的結(jié)合是Ephexin3 自抑制狀態(tài)穩(wěn)定的前提，通過人為設(shè)計(jì)靶向SH3 域的肽段也可以解除Ephexin3 的自抑制狀態(tài)。鳥嘌呤核苷酸交換分析也證實(shí)這種靶向SH3 的肽段能有效增強(qiáng)Ephexin3 催化的鳥苷酸交換反應(yīng)［24］，但是生理狀態(tài)下的具體功能有待進(jìn)一步研究。

Ephexin4 的活性調(diào)控機(jī)制不同于Ephexin1 和Ephexin3，其SH3 域與N20 域互作形成低聚物，阻礙RhoG 的結(jié)合與激活。突變SH3 域與N20 域互作區(qū)域的關(guān)鍵氨酸殘基，Ephexin4 與RhoG 的結(jié)合增加，RhoG 活化增強(qiáng)［25］。當(dāng)吞噬和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1（engulfment and cell motility protein 1，Elmo1）存在時(shí)，由于Elmo1 可以結(jié)合Ephexin4 的SH3 域，導(dǎo)致SH3 域與N20 域的分子內(nèi)互作中斷，從而促進(jìn)RhoG 與Ephexin4 結(jié)合，協(xié)同促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除［26-27］?？傊蛔?、截短及磷酸化分子內(nèi)互作區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸是解除Ephexins家族自抑制狀態(tài)的三大主要方法。

Ephexin2 和Ephexin5 分子內(nèi)互作介導(dǎo)的自抑制暫時(shí)還沒有報(bào)道。

2 Ephexins對Rho蛋白的調(diào)控

Ephexins 作為GEFs 家族中的一員，激活之后調(diào)控Rho 蛋白活性的機(jī)制與其他RhoGEFs 一樣，通過促進(jìn)Rho-GDP 向Rho-GTP 的轉(zhuǎn)換激活Rho 蛋白。GDP 和GTP 結(jié)合態(tài)的變化伴隨Rho 蛋白構(gòu)象的改變，從而決定了Rho 蛋白對下游效應(yīng)因子的親和力，親和作用的變化直接導(dǎo)致相應(yīng)下游信號通路的激活，并以此產(chǎn)生對應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)。

RhoGAPs 通過水解Rho-GTP 上的GTP 促進(jìn)Rho-GDP 產(chǎn)生，雖然Rho 蛋白自身也具有GTP 水解活性，但仍然需要RhoGAPs 加速GTP 的水解，以達(dá)到高效構(gòu)象轉(zhuǎn)換的目的［28］。

RhoGDIs 在胞質(zhì)中結(jié)合并隱藏Rho 蛋白的疏水異戊烯基團(tuán)，抑制Rho 蛋白上的GDP 解離和GTP 水解活性，促使Rho 蛋白遠(yuǎn)離細(xì)胞內(nèi)活躍的膜位點(diǎn)而隔離在胞質(zhì)當(dāng)中［29-30］。

3 Ephexins調(diào)控的相關(guān)疾病

Ephexins 家族成員的活性失調(diào)、功能異常及其相關(guān)聯(lián)的Rho 蛋白活性異常都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。另外，已經(jīng)在不同類型的癌癥中觀察到Eph 受體或Ephrin 配體的異常表達(dá)或突變［2］。所以從這些信號模塊及Rho 蛋白調(diào)節(jié)因子著手可能是Ephexins 調(diào)控相關(guān)疾病治療的一個(gè)方向。

早期腦損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者死亡的主要原因。Fan 等［31］發(fā)現(xiàn)，SAH 小鼠體內(nèi)EphA4 及其下游蛋白Ephexin1、RhoA 和Rho 相關(guān)激酶2（Rho-associated kinase 2，ROCK2）的表達(dá)顯著升高，siRNA 敲減EphA4之后，SAH 相關(guān)異常表型得到改善，提示EphA4/Ephexin1/RhoA/ROCK2 通路可能為人類SAH 的治療提供新的線索。另外，EphA4 及其下游蛋白Ephexin1 還與抑郁癥相關(guān)聯(lián)。當(dāng)使用EphA4抑制劑抑制抑郁樣小鼠體內(nèi)的EphA4表達(dá)時(shí)，小鼠的抑郁樣表型明顯減輕，所以靶向EphA4的藥物研究可能是間接治療抑郁癥的一個(gè)潛在研究方向［32］。因?yàn)橐恍┲苯又委煹乃幬锞哂忻黠@的副作用，比如，去甲丙咪嗪（desipramine）作為一種抗抑郁藥物，通過促進(jìn)EphA4 的聚集而過度激活其下游效應(yīng)因子Src，觸發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)衰減，從而導(dǎo)致記憶受損［33］。而且EphA4 正向信號的過度激活會(huì)破壞脊柱的形態(tài)并阻礙其功能［34］?？傊?，由于Ephexin1 在神經(jīng)元發(fā)育和突觸穩(wěn)態(tài)方面的作用，所以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的恢復(fù)及抑郁癥患者中均能觀察到Ephexin1的異常［31-32］。

Ephexin2 主要在腫瘤中發(fā)揮作用。非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是一種常見的肺癌，約占所有肺癌類型的85%左右［35］。NSCLC 患者體內(nèi)的Ephexin2 水平明顯高于正常人，并以一種獨(dú)立于RhoA 的方式激活MAPK/ERK 通路并促進(jìn)NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移。Li等［36］的研究表明，miR-29b通過下調(diào)Ephexin2 的表達(dá)可以抑制NSCLC 的發(fā)展。另外，肺癌患者組織中粒狀頭樣轉(zhuǎn)錄因子2（grainyhead-like transcription factor 2，GRHL2）高表達(dá)，Pan 等［37］發(fā)現(xiàn)GRHL2 可能通過靶向結(jié)合下游效應(yīng)蛋白RhoG 抑制NSCLC 的轉(zhuǎn)移，所以Ephexin2 與RhoG 在NSCLC 中的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類最致命的癌癥之一，中國是全球肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國家。目前為止，有關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展的研究，大部分集中于RNA 甲基化修飾［38］。Zhou 等［39］的研究表明，Ephexin2 是HCC 中miR-503 的直接靶基因，首次證明miR-503 通過下調(diào)Ephexin2 的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。另外，RhoC 的表達(dá)增加影響HCC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制RhoC 的表達(dá)能有效抑制HCC細(xì)胞的侵襲和遷移，但對細(xì)胞的存活和增殖沒有明顯影響［40］。目前為止，Ephexin2 與RhoC 在HCC 中是否協(xié)同發(fā)揮作用尚未知，但是Ephexin2 與RhoC 很可能成為肝癌的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

Ephexin3 主要在乳腺癌細(xì)胞系及原發(fā)性乳腺癌中表達(dá)，提示Ephexin3 可能在乳腺癌中發(fā)揮一定功能。目前為止，Ephexin3 相關(guān)的乳腺癌介紹較少，不過乳腺癌患者中常見EphA2 的過表達(dá)，以非配體依賴形式促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲［41］。而乳腺癌作為第二普遍和致命的惡性腫瘤，進(jìn)一步研究Ephexin3和EphA2 在乳腺癌中關(guān)系可能很有必要。另外，肺癌患者的全基因組測序結(jié)果顯示Ephexin3 突變頻繁［42］。宮頸癌、結(jié)直腸癌及肺癌患者體內(nèi)都能觀察到較高水平的Ephexin3，并且Ephexin3 與Src 的水平越高，患者生存時(shí)間越短［43-44］。

Ephexin4 對癌細(xì)胞的增殖、生長及腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。Ephexin4 在曲酸刺激的A375 惡性黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，是黑色素瘤細(xì)胞中的腫瘤抑制基因，提示其可能參與癌癥的預(yù)防［45］。但是結(jié)腸癌患者體內(nèi)的Ephexin4 水平明顯升高，Ephexin4 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移依賴于Src 家族激酶成員FYN，通過敲減FYN的表達(dá)可以降低Ephexin4 的蛋白水平，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)展［46］。因此，聯(lián)合靶向Ephexin4和FYN可能是一種相對有效的結(jié)腸癌治療方法。在乳腺癌中，Ephexin4 以RhoG 依賴的方式調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移［41］。另外，EphA2的第897位絲氨酸磷酸化可以增強(qiáng)其與Ephexin4 的結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移［16］。Ephexin4 還與腦腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中，Ephexin4 的錯(cuò)義突變（2125G 到2125A）明顯高于正常人，但是具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明［47］。

Ephexin5 主要與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）及癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。AD 的病理特征之一就是β-淀粉樣蛋白沉積，且AD患者大腦海馬中的Ephexin5 表達(dá)明顯高于正常人。在AD 小鼠模型中，利用shRNA 敲減Ephexin5 或通過Rho 激酶抑制劑處理AD小鼠，都可以挽救AD的行為缺陷，大腦海馬中β-淀粉樣蛋白沉積明顯降低［48-49］，提示靶向AD 患者海馬中β-淀粉樣蛋白是治療AD 的一個(gè)方向。癲癇是Angelman 綜合征（Angelman syndrome，AS）的特征之一，AS 小鼠模型重現(xiàn)了AS 患者的標(biāo)志性特征，其中Ephexin5 蛋白水平升高且發(fā)生折疊錯(cuò)誤是特征之一。Mandel-Brehm 等［50］發(fā)現(xiàn)，降低活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（activity-regulated cytoskeletal-associated protein，Arc）表達(dá)可以緩解AS 引起的癲癇，但是降低AS 小鼠Ephexin5 表達(dá)并不會(huì)改善AS的相關(guān)缺陷。癲癇患者的Ephexin5發(fā)生1810C至1810T 的錯(cuò)義突變，從而降低Ephexin5 對RhoA 的鳥苷酸交換活性［51］，所以可能是Ephexin5 的鳥苷酸交換活性而不是其表達(dá)水平影響了AS 患者的神經(jīng)元興奮性。另外，胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者腫瘤組織中的Ephexin5表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)PDAC 細(xì)胞的增殖與遷移［52］。因此，Ephexin5可能是PDAC的治療靶點(diǎn)之一。

4 結(jié)語

Rho 蛋白在RhoGEFs、RhoGAPs 及RhoGDIs 等調(diào)節(jié)因子的調(diào)控下參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)。Ephexins作為RhoGEFs 中的一員，主要在Ephrin/Eph 信號的介導(dǎo)下參與Rho 蛋白的活性調(diào)節(jié)。大量研究表明，Ephexins 分子內(nèi)互作使Ephexins 的鳥嘌呤核苷酸交換活性處于受抑制的基礎(chǔ)狀態(tài)。Ephexins 的激活及其對Rho 蛋白的調(diào)控對生物體的正常生理生化活動(dòng)至關(guān)重要。關(guān)于Ephexins 自抑制狀態(tài)的解除及活性異常相關(guān)疾病之間的關(guān)系復(fù)雜且尚不完全清楚。深入了解Ephrin/Eph 信號介導(dǎo)的Ephexins 活性調(diào)節(jié)對于闡明相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制十分重要，也將為臨床治療提供靶點(diǎn)，促進(jìn)相關(guān)藥物的研發(fā)。