彭曉娟， 鐘 綠， 吳楚添， 龍 亮， 李 慶，4， 湯紹輝△

（1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州 423000；2柳州市人民醫(yī)院，廣西柳州 545006；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510630；4醫(yī)學(xué)影像人工智能湖南省重點實驗室，湖南郴州 423000）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）在21世紀(jì)的全球流行是對人類健康的主要挑戰(zhàn)之一。NAFLD目前被公認(rèn)為世界上最常見的慢性肝病，在一般人群中發(fā)病率高達30%［1］。NAFLD 包括一系列疾病譜，從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），乃至肝硬化和肝細胞癌［2］。肥胖、高脂血癥、糖尿病、代謝綜合征和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）被公認(rèn)為NAFLD 的危險因素［3-4］。T2DM是一種復(fù)雜的代謝紊亂，其特點為高血糖、低度炎癥、胰島素抵抗和胰島B 細胞分泌不足，主要影響血糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝［5-6］。NAFLD 和T2DM 有共同的危險因素，如肥胖和IR。近年來，NAFLD 在T2DM人群中的發(fā)病率逐年上升，且顯著高于未合并T2DM人群［7-8］。值得注意的是，NAFLD 合并T2DM 對健康的危害更大，更容易引起心血管疾病、慢性腎臟病和癌癥等［3，9］。

目前，對于NAFLD 的治療仍以運動、減重和控制飲食為主，尚無針對NAFLD 的特效藥物［10］。臨床上已有多種治療T2DM 的藥物，盡管這些藥物能夠有效減輕糖尿病癥狀，但存在一定的副作用，如肝腎功能損害、胃腸道反應(yīng)等［11］。目前尚缺乏有效的兼顧治療NAFLD合并T2DM的藥物。

青錢柳（Cyclocarya paliurus）生長于中國南方的山區(qū)中，具有食用及藥物價值。青錢柳葉作為一種傳統(tǒng)中藥，在預(yù)防及治療糖尿病、高血壓及高脂血癥方面有著悠久的歷史［12］。青錢柳葉含有多種具有生物活性的化學(xué)成分，如多糖、黃酮、香豆素、類固醇、三萜等［13］。青錢柳多糖（Cyclocarya paliuruspolysaccharides，CPP）和青錢柳黃酮（Cyclocarya paliurusflavonoids，CPF）作為青錢柳葉的主要活性成分，已在動物實驗中被觀察到具有抗炎、降脂、降糖、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫功能等功效［14-17］。然而，目前尚缺乏關(guān)于CPP 和CPF 對NAFLD 合并T2DM 大鼠模型血糖、血脂及肝臟病變影響的研究。因此，本項工作應(yīng)用NAFLD 合并T2DM 大鼠模型對上述問題進行探討，為臨床上青錢柳用于治療NAFLD 合并T2DM 患者提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 CPP和CPF的制備

青錢柳葉采購于湖南省郴州市明潤生物制品有限公司。

CPP 的制備按照Xie 等［18］的方法進行，簡要步驟如下：將青錢柳葉干燥并粉碎后用95%乙醇浸泡12 h，然后過濾；將濾渣在空氣中干燥后置于95 ℃下用蒸餾水煮2 h（1 mg∶20 mL），重復(fù)以上操作2 次。對得到的混合物進行過濾，保留濾液。將濾液在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后于80%乙醇中放置過夜。將獲得的CPP 中的蛋白用Savag 法去除，并于-40 ℃真空下干燥。最后，應(yīng)用苯酚-硫酸法測定CPP 含量，為79.6%［15］。

CPF 的制備按照Cheng等［19］的方法進行，簡要步驟如下：青錢柳葉粉碎后用95 ℃的蒸餾水提取40 min，提取物在4 500×g下離心15 min，重復(fù)以上操作2 次。將上清液混合，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，殘留物用去離子水溶解，用0.45 μm 微濾膜過濾，然后置于AB-8 樹脂柱上（30 cm×1.6 cm）；收集流出液并進行濃縮，得到CPF 的提取物。最終，應(yīng)用氯化鋁法測定CPF含量，為84.3%［20］。

2 主要試劑

格列吡嗪（glipizide）緩釋片購自輝瑞制藥有限公司；戊巴比妥鈉購自北京市華業(yè)寰宇化工有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）粉劑購自Sigma；檸檬酸鈉緩沖液購自美國賽默飛世爾中國分公司；福爾馬林購自山東省醛業(yè)化工有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購自上海市碧云天生物科技有限公司；空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、血清低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒均采購于南京建成生物工程研究所；大鼠胰島素檢測試劑盒購自R＆amp;D。

3 動物模型制備

SPF級6周齡雄性SD大鼠共60只，體質(zhì)量（180±20）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物實驗開始前，所有大鼠均在（24±2）℃、（55±10）%相對濕度、12 h 明暗周期條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d。本研究符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則，經(jīng)暨南大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)進行實驗。

經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，60 只大鼠隨機分為正常對照（normal control，NC）組（n=10）和NAFLD 合并T2DM模型（NAFLD/T2DM）組（n=50）。NAFLD/T2DM 組大鼠喂飼高脂飼料［high-fat diet，HFD；含有34%脂肪、2%膽固醇、26%碳水化合物、26%蛋白質(zhì)和12%基礎(chǔ)飼料（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）］8 周，接著腹腔注射STZ（25 mg/kg）［21］。此后，連續(xù)10 d 監(jiān)測FBG，均≥11 mmol/L者被認(rèn)為NAFLD/T2DM 造模成功。NC 組大鼠以標(biāo)準(zhǔn)的實驗室飲食喂養(yǎng)8周，接著注射與STZ溶液等體積的檸檬酸鹽緩沖液。本實驗中，成功建立48 只NAFLD/T2DM大鼠。實驗流程見圖1。

Figure 1. Experimental design of the study. HFD：high-fat diet；STZ：streptozotocin；NC：normal control；NAFLD/T2DM：NAFLD complicated with T2DM；CPP：Cyclocarya paliurus polysaccharides；CPF：Cyclocarya paliurus flavonoids.圖1 實驗流程圖

4 實驗分組及處理

將48 只NAFLD/T2DM 大鼠隨機分為NAFLD/T2DM 組（n=12）、CPP 組（n=12）、CPF 組（n=12）和glipizide 組（n=12），并繼續(xù)給予HFD。根據(jù)Wang等［16］的實驗劑量進行適當(dāng)調(diào)整，NAFLD/T2DM 組、CPP 組、CPF 組和glipizide 組分別每天給予蒸餾水、CPP（8 g·kg-1·d-1）、CPF（6 g·kg-1·d-1）和glipizide（2.5 mg·kg-1·d-1）灌胃處理，共12 周；而NC 組則給予標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料喂養(yǎng)12周。

5 檢測指標(biāo)

5.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量監(jiān)測 在實驗期間每周測量大鼠體質(zhì)量并仔細觀察大鼠精神狀態(tài)、體力活動、皮毛情況、攝水量、攝食量、尿量及生存情況。

5.2 血代謝指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束后，所有大鼠均禁食1 晚，第2 天用1%戊巴比妥溶液（40 mg/kg）麻醉，采集腹主動脈血樣，使用商用檢測試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書操作，對FBG、ALT、AST、GGT、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α 及空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）各項指標(biāo)進行檢測。同時，計算穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

5.3 肝臟組織學(xué)觀察及NAFLD 活動度評分（NAFLD activity score，NAS） 實驗結(jié)束后處死大鼠，稱量大鼠肝質(zhì)量（liver mass）并計算肝質(zhì)量指數(shù)（liver mass index）=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。肝臟組織標(biāo)本在10%福爾馬林中性緩沖液中浸泡48 h，常規(guī)處理，石蠟包埋，切成5 μm 薄片，用蘇木精溶液和伊紅染液染色，最后脫水封片。待切片干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理表現(xiàn)，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行脂肪定量分析［22］。NAS 的評價標(biāo)準(zhǔn)見表1［23-24］。

表1 NAFLD活動度評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1. The evaluation standard of NAFLD activity score（NAS）

6 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析均在SPSS 21.0 軟件中執(zhí)行。所有數(shù)據(jù)均用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）及均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。定量資料采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，再采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-WallisH檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 大鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

在實驗期間，共有12 只大鼠因死亡而退出實驗（NC 組1 只，NAFLD/T2DM 組2 只，CPP 組3 只，CPF組3 只，glipizide 組3 只）。與NC 組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠反應(yīng)遲鈍、行動遲緩、煩躁不安、多飲、多食、多尿；CPP 組、CPF 組和glipizide 組大鼠一般狀況較NAFLD/T2DM 組大鼠顯著改善。與NC組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP 組、CPF 組和glipizide 組大鼠體質(zhì)量均顯著增加（P＜0.05），見表2。

2 CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 大鼠肝功能和血脂水平的影響

與NC 組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠肝酶（ALT、AST和GGT）及血脂（TC、TG和LDL-C）水平均顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP 組和CPF組大鼠肝酶（ALT、AST 和GGT）及血脂（TC、TG 和LDL-C）水平均顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），而glipizide 組大鼠肝酶無顯著變化，但TG 水平顯著下降（P＜0.01），見表2、圖2。

Figure 2. Comparison of biochemical results in each group. Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01vs NC group；#P＜0.05，##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.圖2 各組生化結(jié)果比較

表2 各組大鼠體質(zhì)量及生化結(jié)果的比較Table 2. Comparison of body mass and biochemical results in each group

3 CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 大鼠炎癥因子及糖代謝指標(biāo)的影響

與NC 組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠炎癥因子（TNF-α 和IL-6）及糖代謝指標(biāo)（FBG、FINS 和HOMAIR）水平均顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP 組、CPF 組和glipizide 組大鼠炎癥因子（TNF-α 和IL-6）及糖代謝指標(biāo)（FBG、FINS 和HOMAIR）水平均顯著下降（P＜0.01），見表3、圖3。

Figure 3. Comparison of glucose metabolism indexes and proinflammatory cytokines in each group. Mean±SD.n=9.**P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.圖3 各組糖代謝指標(biāo)及炎癥因子的比較

表3 各組大鼠糖代謝指標(biāo)及炎癥因子的比較Table 3. Comparison of glucose metabolism indexes and proinflammatory cytokines in each group

4 CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 肝臟病理變化的影響

與NC 組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠肝質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP 組和CPF 組大鼠肝質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)均顯著下降（P＜0.01），而glipizide 組大鼠肝質(zhì)量無明顯變化，但肝質(zhì)量指數(shù)顯著下降（P＜0.01），見表4、圖4。

肝組織脂肪含量半定量分析結(jié)果顯示，與NC 組相比，NAFLD/T2DM 組大鼠肝組織脂肪變性細胞比例顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP組和CPF 組大鼠肝組織脂肪變性細胞比例均顯著下降（P＜0.01），而glipizide 組大鼠肝組織脂肪變性細胞比例無顯著變化，見表4、圖5。

Figure 5. Hepatic pathological changes. A：from the HE stained sections of the liver，hepatocytes in NC group were observed to be arranged neatly with normal appearance，while diffuse hepatocellular degeneration with huge lipid vacuoles was seen in NAFLD/T2DM group. Both CPP and CPF intervention significantly decreased the above hepatic pathological features. The scale bar=20 μm. B：effects of CPP and CPF on liver fat content. The data in box plot were expressed as median（Q1，Q3）.n=9.*P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD/T2DM group.圖5 肝臟病理學(xué)變化

NAFLD/T2DM 組大鼠NAS 顯著高于NC 組（P＜0.01）；與NAFLD/T2DM 組相比，CPP 組和CPF 組大鼠NAS 顯著降低（P＜0.01），而glipizide 組大鼠則無顯著變化，見表4、圖4。

Figure 4. Comparison of hepatic pathological indexes in each group. Mean±SD.n=9.**P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.圖4 各組肝臟病理學(xué)指標(biāo)的比較

表4 各組大鼠肝臟病理學(xué)指標(biāo)的比較Table 4. Comparison of hepatic pathological indexes in each group

討論

青錢柳為我國特有的單種屬珍稀藥食同源植物，可用于心血管疾病、糖尿病等慢性病的防治。青錢柳含有多種活性成分，主要包括多糖、黃酮、三萜等，具有抗炎、降血糖及降血脂等功效。Lin 等［25］的研究顯示，青錢柳氯仿提取物顯著減輕HFD 誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪變性程度；Yao 等［21］報道，CPP 顯著改善T2DM 模型大鼠糖尿病表現(xiàn)及糖代謝指標(biāo)。青錢柳改善代謝疾病的機制尚未完全明確，可能涉及多個方面。研究顯示，CPP 和CPF 對羥基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有顯著的清除效果，明顯提高超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛含量，增加抗氧化能力，從而對肝損傷模型小鼠起到保護肝臟的作用［26-29］；青錢柳氯仿提取物顯著降低血清非酯化脂肪酸水平，減少肝臟脂質(zhì)從頭合成（de novolipogenesis，DNL），從而抑制NAFLD 大鼠模型肝臟脂肪變性［24］；CPP 和CPF 顯著抑制糖尿病模型小鼠小腸黏膜中的二糖降解酶α-葡萄糖苷酶活性，使葡萄糖吸收減少，進而降低血糖水平［30-32］；張小芳等［33］及許光遠等［34］的研究顯示，CPP 可通過清除糖尿病模型小鼠體內(nèi)H2O2和Fe2+等自由基和抗脂質(zhì)過氧化起到保護胰島細胞作用，并且增強胰島素信號通路關(guān)鍵靶

點胰島素受體和胰島素受體底物2 的表達，發(fā)揮降低血糖作用。

但是，目前尚未見有關(guān)報道CPP 和CPF 對NAFLD 合并T2DM 大鼠模型血糖、血脂及肝臟病變影響的實驗研究。鑒于此，本研究通過HFD 結(jié)合STZ誘導(dǎo)構(gòu)建NAFLD/T2DM大鼠模型，觀察給予CPP和CPF 處理后NAFLD/T2DM 大鼠的一般情況、血液代謝指標(biāo)及肝臟組織病理學(xué)變化。我們的結(jié)果表明，CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 大鼠代謝紊亂及肝臟病理改變的治療效果顯著優(yōu)于glipizide。本研究結(jié)果與已發(fā)表的相關(guān)文獻結(jié)果相似［26，33，35-36］。

總之，本研究探討了CPP 和CPF 對NAFLD/T2DM 模型大鼠代謝異常及肝臟病理改變影響的實驗研究，研究結(jié)果對于臨床上CP 及其活性成分CPP和CPF 用于治療NAFLD 合并T2DM 患者提供了參考資料。