廖冬梅， 龐 芳， 楊云昊， 夏青倩， 李 怡， 郭 嘯， 唐成林△

（重慶醫(yī)科大學(xué) 1中醫(yī)藥學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種年齡相關(guān)的，進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶學(xué)習(xí)能力減退，執(zhí)行功能障礙及焦慮抑郁等神經(jīng)精神癥狀［1-2］。隨著對AD 發(fā)病機制的深入，研究表明該病可能是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)性疾病，神經(jīng)炎癥反應(yīng)處于該病病理過程的中心位置［3-6］。研究顯示，AD 小鼠存在腸道菌群的改變和腸源性炎癥反應(yīng)，通過神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等途徑，腸道菌群可以調(diào)控其腦部的淀粉樣變性和神經(jīng)炎癥反應(yīng)［7-10］。通過調(diào)控腸道菌群的組成，恢復(fù)腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡，抑制腸源性炎癥反應(yīng)以減輕中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)也是目前緩解AD 的途徑之一。研究表明，電針可以調(diào)控AD 小鼠的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善其認(rèn)知功能［11-12］。然而其改善AD 小鼠認(rèn)知能力的作用與腸道菌群間的關(guān)系尚不明確，故本實驗采用電針干預(yù)APP/PS1小鼠，觀察其對小鼠結(jié)腸組織中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、結(jié)腸組織及血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 含量及腸道菌群的影響，探討電針改善AD 小鼠認(rèn)知能力的可能機制。

材 料 與 方 法

1 實驗動物與分組

14 只SPF 級5 月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠及7 只同月齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（29±3）g，均購于南京君科生物工程有限公司，許可證號為SCXK（蘇）2017-0003。代養(yǎng)于恒溫恒濕、12 h/12 h明暗交替、自由攝取食物和水的重慶醫(yī)科大學(xué)IVC 級動物房內(nèi)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將APP/PS1小鼠隨機分為模型（model）組和電針（electroacupuncture，EA）組，以C57BL/6 小鼠作為對照（control）組，每組7 只。所有動物在實驗操作中的處理均符合重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會規(guī)定。

2 主要試劑及儀器

華龍牌針灸針（0.17 mm×7 mm，北京大名科技有限公司）；6805-AⅡ電針治療儀（廣州佳譽醫(yī)療器械有限公司）。NLRP3 抗體（Novus）；β-actin 抗體（Affinity）；小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-18 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（江蘇晶美）；Morris 水迷宮（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）；SMART 3.0 視頻跟蹤平臺軟件（HARVARD APPARATUS）。

3 干預(yù)方法

電針組：將小鼠俯臥位固定于解剖板上，選取“百會”、“大腸俞”和“足三里”穴交替進行電針干預(yù)，選穴參考《實驗針灸學(xué)》［13］?！鞍贂?、單側(cè)“大腸腧”為一組，對側(cè)“大腸俞”及同側(cè)“足三里”為一組，“足三里”隔日交替使用，同側(cè)腧穴分別連接電針儀一對正負極，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強度1.0 mA，于上午9點開始干預(yù)，每日1 次，每次15 min，1 周5 次，連續(xù)5周。模型組和對照組小鼠給予相同的抓取操作，不做其他處理。

4 檢測方法及觀測指標(biāo)

4.1 小鼠糞便收集及檢測 干預(yù)結(jié)束后，于超凈臺上，采用腹部逼迫法收集小鼠新鮮糞便于無菌凍存管中，每次收集完成后立即將糞便樣本放入液氮中，隨后放入-80 ℃冰箱儲存。樣品16S rDNA 檢測由上海中科新生命生物科技有限公司完成。采用CTAB法對小鼠糞便樣本的總基因DNA 進行提取，并通過1%的瓊脂凝膠對DNA 的純度和濃度進行檢測。根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3-V4 可變區(qū)進行PCR擴增。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目標(biāo)片段切膠回收。根據(jù)電泳檢測結(jié)果，進行PCR 擴增，回收產(chǎn)物后用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測，根據(jù)相應(yīng)樣本的測序量要求，按不同比例混合。使用NEBNext＆amp;reg；Ultra ?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫，并通過Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后上機測序；對測序的有效數(shù)據(jù)進行OTUs 聚類和物種分類，基于OTU 的結(jié)果，使用STAMP 分析各組間菌屬的豐度，獲得顯著性差異菌屬；使用QIIME 計算α 多樣性指數(shù)包括Shannon、Chao1 和Goods_coverage 指數(shù)，并繪制Shannon 曲線；運用R 包進行PCOA 分析并繪圖。

4.2 Morris水迷宮 5周干預(yù)結(jié)束后，采用Morris水迷宮評估各組小鼠的認(rèn)知能力［14］。按照東西南北四個方向?qū)⑺鼐譃? 個象限（SW、NW、NE 和SE），每個象限池壁上均貼有顏色形狀區(qū)別明顯的標(biāo)記物，實驗過程中標(biāo)記物的位置固定不變，池壁外周懸掛簾布以減小實驗人員的干擾。實驗時在NE 象限放置一個圓柱形的平臺（直徑6 cm，高14 cm），并將水注入池內(nèi)，水溫恒定在（24±2）℃，水的高度以高于平臺1 cm 為宜。正式實驗前1 d，將小鼠帶至實驗房間內(nèi)，放在水迷宮平臺上10 s 以適應(yīng)環(huán)境，以SW 象限為入水點讓每只小鼠在水池內(nèi)自由游泳60 s，以排除小鼠視力、運動障礙對實驗結(jié)果的干擾。

4.2.1 定位航行實驗 將各組小鼠按尾部編號依次從4個象限面壁放入水中，記錄每只小鼠在4個象限從入水到游上平臺所用的時間（逃避潛伏期），若60 s 內(nèi)小鼠未游上平臺，引導(dǎo)其找到平臺，并于平臺上學(xué)習(xí)30 s，逃避潛伏期記為60 s。定位航行實驗訓(xùn)練5 d。

4.2.2 空間探索實驗 訓(xùn)練第6 天時撤除平臺，將小鼠直接從SW 象限（NE 象限的對側(cè)）放入水池，記錄60 s 內(nèi)其穿越平臺的次數(shù)?？臻g探索實驗訓(xùn)練1 d。

4.3 取材方法 行為學(xué)檢測結(jié)束后，所有小鼠采用異氟烷吸入麻醉，固定四肢，打開腹腔，暴露腹主動脈，用1 mL 無菌注射器從腹主動脈處緩慢吸取血液后，置于促凝管內(nèi)靜置離心。打開胸腔，暴露心臟，于心尖處進針至主動脈弓內(nèi)，注入0.01 mol/L 的PBS溶液，同時剪開右心耳，使血液流出至肝臟變?yōu)闇\棕色，清澈液體從右心耳流出后，于冰上沿著胃幽門端向下找到一囊狀物（盲腸），取下其后約3 cm 的結(jié)腸組織。結(jié)腸組織采用PBS溶液沖洗后，置于-80 ℃冰箱儲存。

4.4 ELISA 檢測各組小鼠血清及結(jié)腸TNF-α、IL-1β和IL-18 含量 每只小鼠分別稱取20 mg 結(jié)腸組織，加入適量PBS 溶液，充分勻漿后收集上清液，分裝備檢。具體操作按說明書進行。

4.5 Western blot 檢測小鼠結(jié)腸NLRP3 蛋白表達采用RIPA 裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)濃度配制蛋白樣品，并于SDSPAGE 上分離，隨后轉(zhuǎn)膜，封閉，于4 ℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜（NLRP3：1∶1 000；β-actin：1∶1 000），Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光成像，Image J 分析并計算目的蛋白相對表達量。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 25 處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）形式表示。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則采用單因素方差分析，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量的方差分析；進一步兩兩比較時，方差齊用Bonferroni法，方差不齊采用Dunnett T3法；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis 檢驗，菌群結(jié)果則采用Wilcox 檢驗；STAMP 結(jié)果采用Welch檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Morris水迷宮實驗

1.1 定位航行實驗 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠逃避潛伏期總體均呈下降趨勢。從第2 天開始，與對照組比較，模型組逃避潛伏期延長（P＜0.05），第3 天開始，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，電針組逃避潛伏期的下降趨勢更為顯著，且在第5 天，其逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。見圖1A。

1.2 空間探索實驗 與對照組比較，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05）。見圖1B。

Figure 1. Comparison of escape latency（A）and number of crossing the platform（B）in each group of mice. Mean±SD.n=7.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖1 各組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較

2 結(jié)腸組織中NLRP3蛋白的表達

與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組NLRP3表達降低（P＜0.05）。見圖2。

Figure 2. Comparison of expression of NLRP3 in colon of mice in each group. Mean±SD.n=4.**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3表達的比較

3 結(jié)腸組織中炎癥因子的含量

與對照組相比，模型組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-18 含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量降低（P＜0.05）。見圖3。

Figure 3. Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-18 in colon of mice in each group. Mean±SD.n=7.**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-18含量比較

4 血清炎癥因子含量

與對照組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組血清TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量的比較Table 1. Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-18 in serum of mice in each group（ng/L. Mean±SD.n=7）

5 腸道菌群多樣性分析

Shannon指數(shù)結(jié)果顯示（表2），與對照組相比，模型組小鼠Shannon 指數(shù)降低，腸道菌群多樣性減少，電針干預(yù)后，其Shannon指數(shù)增高，菌群多樣性增加，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；Chao1 指數(shù)結(jié)果顯示（表2），與對照組相比，模型組Chao1 指數(shù)降低，腸道菌群數(shù)目減少（P＜0.05），電針干預(yù)后，Chao1 指數(shù)增高，菌群數(shù)目增加（P＜0.05）；Goods_coverage 指數(shù)各組無明顯變化，見表2；Shannon 曲線結(jié)果及PCOA 分析結(jié)果見圖4，3 組組內(nèi)各樣本間距離較小，組間各樣本間距離較大。

6 門水平菌群組成分析

在門水平，3 組小鼠糞便菌群均以Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）為主，兩者相對豐度總和在對照組、模型組、電針組中分別占比97.17%，98.17%和94.46%。除此之外，豐度排名前10 的菌群還有Actinobacteria（放線菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Epsilonbacteraeota、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Patescibacteria、Deferribacteres（脫鐵桿菌門）、Cyanobacteria（藍藻菌門）和Tenericutes（軟壁菌門）。與對照組相比，模型組小鼠糞便擬桿菌門相對豐度增高（P＜0.05），厚壁菌門、Patescibacteria和軟壁菌門相對豐度降低（P＜0.05），電針干預(yù)后擬桿菌門相對豐度輕度降低，厚壁菌門、Patescibacteria、軟壁菌門相對豐度輕度升高，但差異較模型組均無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

Figure 5. Relative abundance of microbiota in top 10 at the phylum level in each group.n=6.圖5 各組在門水平排名前10的菌群的相對豐度

7 組間差異菌屬的STAMP分析

在屬水平，各組菌群分析結(jié)果見圖6。與對照組相比，模型組Lactobacillus（乳桿菌）、Candidatus Saccharimonas、Ruminiclostridium 6（瘤胃梭菌6）、Ruminococcaceae UCG-014（瘤胃球菌UCG-014）、Ruminiclostridium 9（瘤胃梭菌9）、Parabacteroides（副擬桿菌）、Christensenellaceae R-7 group、Eubacterium nodatum group、Family ХШ AD3011 group、Ruminococcaceae UCG-004、GCA-900066225、UBA1819、A2、Candidatus Soleaferrea、Anaerofustis（厭氧菌）（均P＜0.05）相對豐度顯著降低（P＜0.05）；uncultured Bacteroidales bacterium、Others、uncultured organism、Rikenella（理研菌）、Coriobacteriaceae UCG-002（紅蝽菌UCG-002）（均P＜0.01）、Parasutterella（副薩特氏菌）、Marvinbryantia、Ruminococcus torques group相對豐度增高（P＜0.05）。與模型組相比，電針組副薩特氏菌、Streptococcus（鏈球菌）、Rikenella、Caulobacter相對豐度降低（P＜0.05）；Muribaculum、Candidatus Saccharimonas、Adlercreutzia、mouse gut metagenome、uncultured diatom、hgcl clade、Cyanobium PCC-6307、metagenome、Candidatus Methylopumilus、Microcystis PCC-7914相對豐度增高（P＜0.05）。

Figure 6. STAMP analysis of differential microflora between the control group and the model group（A），the model group and the EA group（B）at the genus level.n=6. The bar plot shows mean proportions of differential microflora at genus level，the difference in proportions between the groups is shown with 95%confidence intervals，and onlyP＜0.05 are shown.圖6 對照組與模型組及模型組與電針組在屬水平差異菌群的STAMP分析

在屬水平，三組乳桿菌、雙歧桿菌和副擬桿菌相對豐度比較結(jié)果見圖7，與對照組相比，模型組乳桿菌和副擬桿菌相對豐度降低（P＜0.05），雙歧桿菌相對豐度稍有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；電針干預(yù)后，三者豐度增高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

Figure 7. Comparison of relative abundance ofLactobacillus（A），Bifidobacterium（B）andParabacteroides（C）among different groups at genus level. Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.圖7 各組屬水平乳桿菌、雙岐桿菌和副擬桿菌相對豐度比較

討論

AD 是一種老年人常見的神經(jīng)精神類疾病，認(rèn)知能力下降是其早期的癥狀之一。研究顯示［15］，外周血炎癥反應(yīng)是認(rèn)知能力下降的危險因素，其與年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降正相關(guān)。作為替代醫(yī)學(xué)的組成部分，電針被廣泛用于神經(jīng)精神類疾病的治療，并被證實通過調(diào)節(jié)腸道菌群，借助于“微生物-腸-腦軸”改善衰老大鼠的認(rèn)知障礙和中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)［16］。與以往僅關(guān)注AD 小鼠腦部病變的研究不同，本實驗以“微生物-腸-腦軸”為著眼點，探討電針對AD 小鼠腸道菌群及相關(guān)炎癥因子的影響，分析電針改善其認(rèn)知障礙的可能機制。

作為胃腸道兩大優(yōu)勢菌門，厚壁菌門和擬桿菌門比值（F/B）的增加或減少分別與肥胖、炎癥性腸病的發(fā)展有關(guān)［17］。Cui等［18］認(rèn)為，厚壁菌門豐度與胃腸道炎癥負相關(guān)，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中F/B 值降低，推測F/B 值的降低與結(jié)腸炎癥性反應(yīng)有關(guān)。本實驗糞便菌群組成結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠糞便擬桿菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低，F(xiàn)/B 值降低，電針治療在一定程度上可提高其F/B 值。表明APP/PS1小鼠腸道可能存在炎癥反應(yīng)，而電針治療可以通過調(diào)節(jié)厚壁菌門、擬桿菌門的豐度來改善其腸道炎癥反應(yīng)。

研究表明［19］，在急性壞死性胰腺炎和藥物誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠糞便中，Candidatus Saccharimonas豐度降低，且其與IL-17 和TLR4 等炎癥相關(guān)蛋白的水平負相關(guān)，推測其在維持腸道的正常功能中發(fā)揮作用。Chen等［20］觀察到，在腸易激綜合征小鼠糞便中，副擬桿菌屬豐度降低，副薩特氏菌屬豐度增高，且副擬桿菌屬與腸道慢性炎癥負相關(guān)，副薩特氏菌屬與腸道慢性炎癥正相關(guān)。同時研究顯示［21］，理研菌與IL-2 和IL-4 等炎癥因子正相關(guān)，并與慢性全身性炎癥性疾病相關(guān)，表明其可能促進炎癥反應(yīng)。作為炎癥過程的啟動器，NLRP3能識別病原體并被其激活，導(dǎo)致IL-1β 和IL-18 等炎癥因子釋放，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)［22］。在本研究中，APP/PS1小鼠糞便中Candidatus Saccharimonas、副擬桿菌屬豐度降低，副薩特氏菌屬、理研菌屬豐度增高，促炎菌與抗炎菌失衡，腸道菌群微環(huán)境破壞，NLRP3被過度激活，其下游炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-18 過度釋放，腸道慢性炎癥反應(yīng)明顯，外周血炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-18 水平顯著增高，電針干預(yù)后，上述促炎菌豐度降低，抗炎菌豐度增高，促炎菌與抗炎菌趨近平衡，腸道微環(huán)境向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)換，NLRP3表達被抑制，下游炎癥因子釋放減少，腸道和外周血炎癥反應(yīng)減輕，表明電針可能通過調(diào)控腸道菌群，抑制其導(dǎo)致的炎性小體的激活和炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎保護作用，減輕腸源性和外周血炎癥反應(yīng)。

研究表明［23-25］，外周血TNF-α 和IL-1β 水平增高可導(dǎo)致血腦屏障（blood brain barrier，BBB）緊密連接蛋白claudin-5 和ZO-1 表達降低，且其與血管內(nèi)皮細胞TNF-α 和IL-1β 受體結(jié)合后可損傷內(nèi)皮細胞并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2 和9 表達，破壞基底膜成分，導(dǎo)致BBB 結(jié)構(gòu)破壞，通透性增加。BBB 通透性增加后，外周血炎癥因子及有害物質(zhì)進入腦組織，導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞或相關(guān)炎癥反應(yīng)通路激活，誘發(fā)中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷，認(rèn)知能力下降［16，26］。研究顯示［27-29］，AD小鼠BBB緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin 表達降低，BBB 通透性增加，而電針治療可以上調(diào)上述蛋白的表達，改善小鼠BBB 結(jié)構(gòu)。He等［16］證實電針刺激還可降低衰老大鼠血清IL-1β、TNF-α和LPS的水平，上調(diào)BBB 中ZO-1的表達，降低BBB 通透性，抑制海馬LPS 的表達和TLR4/NF-κB 通路的激活，發(fā)揮抗炎和保護海馬神經(jīng)元的作用，改善大鼠的認(rèn)知障礙。由此推測電針治療改善AD 小鼠認(rèn)知障礙的機制可能也與調(diào)節(jié)BBB 結(jié)構(gòu)及通透性，減輕外周炎癥因子所致中樞炎癥通路的激活，減少神經(jīng)元損傷有關(guān)。

本實驗研究結(jié)果顯示，除炎癥相關(guān)菌群改變外，APP/PS1小鼠糞便乳桿菌、雙歧桿菌、Muribaculum等與認(rèn)知相關(guān)的菌群豐度也降低。研究表明［30］乳桿菌、雙歧桿菌與γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的產(chǎn)生密切相關(guān)。GABA 是腦組織中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與神經(jīng)系統(tǒng)功能的發(fā)育相關(guān)，GABA系統(tǒng)的功能紊亂會導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷［31］；相關(guān)分析顯示［32］，Muribaculum相對豐度與APP/PS1小鼠認(rèn)知功能正相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，電針干預(yù)后APP/PS1小鼠逃避潛伏期縮短，空間探索能力提高，腸道Muribaculum相對豐度顯著增高，乳桿菌、雙岐桿菌相對豐度也呈上升趨勢，表明電針可能通過增加認(rèn)知相關(guān)菌屬的豐度來改善AD小鼠的認(rèn)知能力。

綜上所述，電針改善APP/PS1 小鼠認(rèn)知障礙的機制可能與其調(diào)控腸道菌群，降低結(jié)腸NLRP3 蛋白表達和結(jié)腸、外周血IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平，減輕腸源性及外周血炎癥反應(yīng)，從而降低認(rèn)知障礙的危險因素有關(guān)。但炎癥反應(yīng)與認(rèn)知障礙間的具體關(guān)系以及電針治療在其中的作用機制仍需我們進一步研究。