劉繼光， 宋 佳， 李秋萍， 趙志宇， 胡建新

(佳木斯大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

氯酚類化合物大多數(shù)具有致畸、致癌以及致突變性，其中2,4-二氯酚(DCP)和2,4,6-三氯酚(TCP)因毒性較高一直被美國環(huán)保局列入優(yōu)先控制污染物名單[1]。近來科學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，很多氯酚類化合物對人類的各種危害中，尤以遺傳性疾病和癌癥備受關(guān)注。目前，國際上用于評價致突因素的常用方法為哺乳動物細胞致突變試驗，該試驗主要以V79細胞為模型細胞，通過檢測細胞中HGPRT基因位點的突變確定受試物的致突性[2]。然而此方法存在周期長，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等缺點。近年來，新興起的細胞電化學(xué)是電化學(xué)原理、實驗方法與細胞、分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一個新的前沿領(lǐng)域，它通過檢測細胞內(nèi)具有電活性物質(zhì)的電化學(xué)信號，反映各種生命過程[3-5]。采用電化學(xué)方法研究了DCP與TCP致V79細胞HGPRT基因突變的電化學(xué)信號變化特征，為哺乳動物細胞致突變試驗電化學(xué)新方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1V79細胞購于上海細胞庫，多壁碳納米管購于深圳納米港有限公司，胎牛血清購于Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司，2,4,6-三氯酚和2,4-二氯酚購于百靈威科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 V79細胞的培養(yǎng)與處理

V79細胞培養(yǎng)在5 %濃度CO2，溫度37 ℃，100 %飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，使用的培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清、1 %非必需氨基酸、谷氨酰胺和雙抗)。收集V79細胞后加入適量PH值為7.4的PBS溶液，在水浴恒溫50 ℃加熱裂解30 min后進行電化學(xué)檢測[6]。

1.2.2 修飾電極的制備及電化學(xué)檢測

多壁碳納米管/離子液體修飾玻碳電極制備，將適量離子液體與多壁碳納米管混合物均勻涂于玻碳電極表面，室溫干燥。電化學(xué)檢測采用電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，以三電極體系進行，其中工作電極為多壁碳納米管/離子液體修飾玻碳電極，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極[7]。

1.2.3 V79細胞基因突變常規(guī)法檢測

V79細胞接觸受試物3 h后繼續(xù)培養(yǎng)8d，然后以每皿2×105個細胞接種于100 mm的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)；貼壁后，加6-巰鳥嘌呤使藥物濃度達到5μg·mL-1，培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-10d，加入甲醇進行細胞固定，15 min后進行染色，計算突變率的同時計算各培養(yǎng)皿的細胞集落數(shù)。測定集落形成率，在另一不加6-巰鳥嘌呤的培養(yǎng)皿中接種200個細胞，剩余步驟同上，計算方法同上(注意：集落數(shù)：聚集細胞個數(shù)≥50為一集落)。溶劑對照組的集落數(shù)為100 %，計算受試藥物各濃度的相對集落形成率，結(jié)果即為受試物產(chǎn)生的細胞毒性。

相對集落形成率 = 實驗組集落形成率/溶劑對照組集落形成率

突變率 = 突變集落數(shù)/(接種細胞數(shù)×集落形成率)

1.2.4 V79細胞HGPRT基因突變的電化學(xué)檢測

將V79細胞分為受試物組、甲磺酸乙酯(EMS)陽性對照組和二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照組。加藥3 h后換DMEM完全培養(yǎng)基，每2d傳代一次，培養(yǎng)9d，電化學(xué)檢測時間周期為48 h。

將不同受試物組細胞加入6-硫鳥嘌呤培養(yǎng)8-10d后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代2次后，消化計數(shù)，獲得3×106cells·mL-1完全突變V79細胞，對同濃度完全突變與未突變細胞進行電化學(xué)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)法檢測氯酚類化合物對V79細胞HGPRT基因突變

由表1可知，DMSO溶劑對照組的突變率為6.2×10-6；EMS陽性對照組的突變率為613×10-6；濃度為400 μmol·L-1的氯酚類化合物DCP、TCP的突變率分別為564×10-6和710×10-6；兩種化合物的突變率與陽性對照組相近為典型的陽性反應(yīng)。采用氯酚類化合物DCP和TCP做為受試物，標準致突物EMS為陽性對照組的常規(guī)檢測法結(jié)果符合體外哺乳動物細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗結(jié)果，說明氯酚類化合物DCP和TCP可以致哺乳動物細胞HGPRT基因突變。并且常規(guī)檢測結(jié)果顯示同樣400μmol·L-1濃度下氯酚類化合物突變率大小順序為：TCP>DCP。

表1 DCP和TCP對V79細胞HGPRT基因位點突變頻率的影響

2.2 雙信號電化學(xué)法檢測氯酚類化合物致V79細胞HGPRT基因突變

采用原位電化學(xué)法檢測了TCP和DCP對V79細胞的致突變作用。由圖1可知，V79細胞在接觸濃度為400 μmol·L-1的氯酚類化合物TCP和DCP后，自表達第三天開始，其電化學(xué)信號峰的峰高明顯高于DMSO溶劑對照組，表達第五天達到最高點，出現(xiàn)與EMS陽性對照組相同的趨勢。圖2為氯酚類化合物DCP、TCP誘變天數(shù)與信號Ⅱ峰高關(guān)系圖，由圖可知，V79細胞在接觸受試物后，信號Ⅱ峰高在表達第三天開始明顯區(qū)別于DMSO溶劑對照組，出現(xiàn)與信號Ⅰ峰高相同趨勢。

圖1 電化學(xué)信號I(0.69 V)隨DCP和TCP對V79細胞誘變時間變化圖

圖2 電化學(xué)信號II(1.03 V)隨DCP和TCP對V79細胞誘變時間變化圖

2.3 完全突變細胞的電化學(xué)信號響應(yīng)

將正常V79細胞在接觸不同受試物后培養(yǎng)8天加入6-硫鳥嘌呤篩選出完全突變細胞，檢測相同濃度細胞電化學(xué)信號變化，見圖3。在相同細胞量3×106cells·mL-1的情況下，接觸了DCP與TCP的完全突變細胞，電化學(xué)信號峰大于正常V79細胞，EMS陽性對照組同樣大于正常V79細胞，而DMSO溶劑對照組的電化學(xué)信號峰小于正常V79細胞。

圖3 完全突變細胞電化學(xué)信號強度差異細胞濃度：3×106 cells·mL-1

3 結(jié) 語

氯酚類化合物大多數(shù)具有致畸、致癌作用。常規(guī)哺乳動物細胞致突變試驗結(jié)果顯示，DCP與TCP均具有明顯的致突變，且TCP的致突變作用強于DCP。V79細胞接觸了氯酚類化合物DCP和TCP后，在表達的第三天受試物組既出現(xiàn)明顯高于溶劑對照組電化學(xué)信號峰的趨勢，并在第五天達到最高點。此趨勢與EMS陽性對照組相似。對同細胞量完全突變與未突變細胞進行電化學(xué)檢測比較，其結(jié)果顯示，在同樣細胞數(shù)量下完全突變細胞的電化學(xué)信號峰高與EMS陽性對照組相似，均大于正常V79細胞。而未突變細胞的電化學(xué)信號峰與DMSO溶劑對照組相似，均小于正常V79細胞。以上結(jié)果說明，電化學(xué)法可以檢測到氯酚類化合物DCP和TCP致哺乳動物細胞HGPRT基因突變的特征性變化，有望發(fā)展成為一種新的哺乳動物細胞致突變試驗。