梁 好，徐學(xué)明

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214000）

食源性疾病是當前食品安全面臨的重大問題，已成為全球性公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全世界范圍內(nèi)每年有數(shù)十億人患有食源性疾病，其中，我國每年發(fā)生食源性疾病人數(shù)近千萬人次[1]。因此，對食品危害物進行快速、靈敏檢測，對降低食源性疾病發(fā)生率、提高國民身體健康度及維護國家社會穩(wěn)定性具有非常重要的作用。

目前，常見的食品危害物檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法、平板分離法等。其中，儀器分析法包括氣相色譜法、高效液相色譜法等，這類方法具有精密度高、重復(fù)性好的優(yōu)點，但所用儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜；免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫測定法等，但由于抗體制備成本高、重復(fù)性差，現(xiàn)場檢測的運用受到限制；平板分離法主要用于致病菌的檢測，結(jié)果穩(wěn)定性較好，但檢測周期較長，一般需要3～5 d[2]。

20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的核酸適配體分子探針給食品危害物的檢測帶來了新的機遇。核酸適配體（Aptamer）又稱“化學(xué)抗體”，是一種能折疊成特定三維結(jié)構(gòu)并特異性結(jié)合靶標分子的單鏈DNA或RNA，一般長度在20～100個堿基之間[3]。它可以通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）從體外篩選獲得，目前很多致病菌、真菌毒素、重金屬離子等食品危害物的核酸適配體均已有報道。此外，目前很多體外篩選獲得的核酸適配體序列初始長度為80 bp左右[4]，隨著人們對核酸適配體研究的深入，越來越多的研究表明，對核酸適配體序列進行截短、裂分優(yōu)化后，其仍然保有原有的功能性質(zhì)，甚至識別性能更優(yōu)越[5]。與此同時，通過序列優(yōu)化還可以進一步揭示核酸適配體序列結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，有利于理解核酸適配體-靶標作用機制。因此，核酸適配體的序列優(yōu)化及作用機制等方面的研究已逐漸成為研究熱點。本文主要總結(jié)了近年來已報道的食品危害物核酸適配體的序列優(yōu)化及其應(yīng)用情況，以期為今后食品危害物核酸適配體生物傳感器的開發(fā)和應(yīng)用提供借鑒。

1 食品危害物核酸適配體序列優(yōu)化現(xiàn)狀

截至目前，已報道的食品危害物核酸適配體大約有80種，主要包括抗生素、致病菌、農(nóng)獸藥殘留、生物毒素等，其中約有23種已被報道進行序列優(yōu)化，占比28.8%，具體如表1所示。由此可見，對核酸適配體序列進行優(yōu)化正逐漸受到廣大研究人員的關(guān)注。從表1還可以看出，目前優(yōu)化效果顯著的食品危害物核酸適配體序列之一為β-羽扇豆球蛋白，優(yōu)化后其長度縮短為11 bp，為最初適配體序列長度的12%，其親和力提高了約211倍，檢測靈敏度達150 pM，相較基于抗體的ELISA技術(shù)具有明顯的提升。因此，對核酸適配體序列進行優(yōu)化不僅可以降低序列合成成本，還有利于改善其生物傳感器的性能。

表1 近年來已報道的食品危害物截短核酸適配體

2 食品危害物核酸適配體序列優(yōu)化方法

對核酸適配體序列優(yōu)化的目的主要包括兩個方面：①縮短序列長度，降低合成成本；②提升核酸適配體穩(wěn)定性，增強其應(yīng)用能力?；谝陨夏康模斍皩怂徇m配體序列進行優(yōu)化的方法主要包括截短優(yōu)化、裂分優(yōu)化及突變優(yōu)化等。

2.1 截短優(yōu)化

經(jīng)過SELEX技術(shù)從核酸文庫中篩選的能特異性結(jié)合靶標的核酸適配體全長一般在80 bp左右。近年來有很多研究表明，篩選得到的序列并不是全部參與靶標的結(jié)合，真正與靶標特異性結(jié)合的核苷酸通常不大于15個[31-32]。ZHOU等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，當核酸適配體與靶標分子結(jié)合時，非必需核苷酸的存在將干擾這一過程的進行。ZHENG和GAO[34-35]等人研究表明，較短的核酸適配體序列具有更好的結(jié)合親和力與靶標特異性。CHINNAPPAN等人[16]將岡田酸（Okadaic Acid，OKA）適配體截短為兩個序列，一個標記為6-羧基熒光素（FAM），另一個標記有淬滅基團，構(gòu)建了OKA的熒光檢測方法。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，相較于全長適配體序列（Kd=526 nmol/L），截短后的核酸適配體具有更卓越的結(jié)合能力（Kd=2.77 nmol/L）。以上研究結(jié)果表明，采用截短優(yōu)化的方法有利于提高核酸適配體的識別與結(jié)合能力，降低序列合成成本，從而有利于開發(fā)更經(jīng)濟實惠的生物傳感器。

2.2 裂分優(yōu)化

2000年，STOJANOVIC等[36]首次報道將可卡因核酸適配體裂分成長度分別為16 bp和27 bp的兩條鏈，并成功構(gòu)建了三明治夾心型核酸適配體熒光生物傳感器，實現(xiàn)了可卡因的檢測。至此，裂分核酸適配體逐漸受到人們關(guān)注。水胺硫磷（ICP）作為一種廣譜性殺蟲、殺螨劑，因其高毒性作用被禁止用于蔬菜、部分果樹及中草藥等作物。LI等人[13]將長度為54 bp的水胺硫磷（ICP）核酸適配體裂分成24 bp和30 bp兩個片段，結(jié)合多壁碳納米管（MWCNT）和G四鏈體構(gòu)建了一種無酶、免標記的熒光檢測方法，該方法具有較強的選擇性和靈敏性，在最佳條件下檢測限達10 nmol/L。根據(jù)目前的報道，裂分型核酸適配體數(shù)量不多，在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用遠少于截短優(yōu)化，其中針對食品危害物核酸適配體本身的裂分方法更加有限。除了起步晚之外，其主要原因可能是適配體和靶標的結(jié)合機制尚未明晰，從而導(dǎo)致裂分成功率不高。

2.3 突變優(yōu)化

突變優(yōu)化主要是對核酸適配體上的單個或多個堿基進行化學(xué)修飾或堿基突變，以提高其穩(wěn)定性和結(jié)合性能。這種優(yōu)化方式常有助于理解并揭示核酸適配體與靶標分子的結(jié)合機制。SUN等人[21]對副溶血弧菌核酸適配體進行截短優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)CAGTGA組成的6堿基環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能是靶標結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，因此作者采用定點突變的方式對這部分序列進行優(yōu)化，當這部分序列被其他堿基取代后，適配體序列親和力大大降低，由此證明了這一結(jié)構(gòu)對危害物識別過程的重要性。

3 食品危害物截短核酸適配體生物傳感器應(yīng)用

生物傳感器是將專一性的生物感應(yīng)件元件與能夠產(chǎn)生和待測物濃度成比例的信號傳導(dǎo)器相結(jié)合的一種能實現(xiàn)對待測物進行定性或定量分析的裝置[37]。相對于其他類型生物傳感器，核酸適配體生物傳感器作為一種新興技術(shù)，具有更好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，在食品安全檢測領(lǐng)域的研究報道越來越多。根據(jù)其傳導(dǎo)信號的不同，可將其分為熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器和電化學(xué)適配體傳感器等。

3.1 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器是根據(jù)核酸適配體與待測物質(zhì)特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號而建立的一類傳感器。由于熒光的變化強度常常與待測物濃度成正比關(guān)系，因此可以對靶標進行定量測定。CHINNAPPAN等人[27]認為篩選獲得的核酸適配體序列其引物結(jié)合區(qū)可能不參與適配體/靶標復(fù)合物的形成，基于此，他們將蝦過敏原——原肌球蛋白（TM）適配體序列的兩端引物結(jié)合區(qū)序列截短去除，基于Mfold軟件預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計了兩條長度分別為14 bp和25 bp的序列。然后將此兩條截短序列和母序列分別作為分子探針構(gòu)建了一種基于氧化石墨烯（GO）納米材料的熒光適配體傳感器。由于適配體與氧化石墨烯的共軛作用，熒光標記的核酸適配體被吸附在GO上時，熒光被猝滅，在沒有TM時，體系的熒光強度保持不變，當TM出現(xiàn)時，TM和核酸適配體特異性結(jié)合，將其從GO表面解離下來，熒光得到恢復(fù)，從而可以實現(xiàn)TM的檢測。研究結(jié)果表明，截短后獲得的長度為25 bp的序列其親和力比母核酸適配體提高了4倍，檢測限（LOD）可達2 nmol/L。該傳感器在使用TM加標的樣品中展現(xiàn)出良好的性能并實現(xiàn)了97%±10%的回收率，此外還具有選擇性好、檢測快速等優(yōu)點，在30 min內(nèi)即可完成檢測。

3.2 比色適配體傳感器

和熒光適配體傳感器相比，比色適配體傳感器具有實驗結(jié)果肉眼可見的特點，無需復(fù)雜設(shè)備即可完成對待測危害物的檢測。金納米顆粒（Au NPs）是最常用的比色法檢測的納米材料，由于其易于合成、修飾，已被廣泛用作比色適配體傳感器。TIAN等人[12]基于納米金構(gòu)建了農(nóng)藥殘留物啶蟲脒的比色適配體傳感器。他們從49 bp的核酸適配體序列中刪去多余的側(cè)翼核苷酸，獲得了43 bp、40 bp、37 bp和25 bp 4條序列。研究發(fā)現(xiàn)截短后的25 bp長的截短序列對啶蟲脒具有更好的親和力，隨后他們以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了基于納米金的截短核酸適配體生物傳感器檢測方法，其靈敏度是母序列的3.5倍。

3.3 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)適配體傳感器是指將識別元件與靶標物質(zhì)的特異性結(jié)合轉(zhuǎn)化為電流信號的一類傳感器。常見的電化學(xué)分析技術(shù)有差分脈沖伏安法（DPV）、電化學(xué)阻抗法（EIS）、方波伏安法（SWV）、循環(huán)伏安法（CV）等，其中已報道的應(yīng)用于食品危害物檢測方面的方法較為有限。SVIGELJ等[28]將相應(yīng)的核酸適配體序列從40 bp截短優(yōu)化至長度僅為19 bp的短序列，并以此序列開發(fā)了一種夾心式的電化學(xué)傳感器，用于谷蛋白的檢測。研究結(jié)果表明，與原始母核酸適配體分子探針相比，這種以截短核酸適配體構(gòu)建的三明治式傳感器的檢測更加靈敏。

4 結(jié)語

由食品危害物導(dǎo)致的食源性疾病正嚴重危害著人們的身體健康，因此建立方便、快捷及靈敏的食品危害物檢測方法尤為重要。經(jīng)過序列優(yōu)化后的適配體具有良好的親和力、識別特性及選擇性，能夠在降低實驗成本的同時極大地提高檢測靈敏度，已被廣泛用于構(gòu)建熒光、比色、電化學(xué)等適配體傳感器。但核酸適配體的序列優(yōu)化仍有提升的空間，需要將核酸適配體構(gòu)效關(guān)系、作用機制等與序列優(yōu)化結(jié)合起來以提升優(yōu)化效果。同時，在核酸適配體生物傳感器方面，非標記型生物傳感器逐漸受到青睞，可能是今后重點發(fā)展的研究方向之一。相信在廣大科研工作者的不懈努力下，核酸適配體序列的優(yōu)化效率將會更高、技術(shù)更成熟，在食品安全檢測方面必將得到長足的應(yīng)用。