何 江

（貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，貴州貴陽 550081）

雞蛋營養(yǎng)豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，是餐桌上常見的食品。氯霉素類抗生素具有廣譜性，能有效治療動物疾病。但是，氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，如能抑制人體骨髓造血功能，引起人體的再生障礙性貧血，粒狀白細(xì)胞缺乏癥[1]。由于氯霉素類藥物價(jià)格低廉，療效好，在畜禽養(yǎng)殖過程中會殘留在雞蛋中，對人們的健康和環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重危害，我國已經(jīng)明確規(guī)定氯霉素不得在雞蛋中檢出[2]。

QuEChERS前處理方法具有快速、簡便、廉價(jià)、有效、耐用、安全等特點(diǎn)，是近年來應(yīng)用廣泛的樣品前處理技術(shù)，常常用于獸藥殘留分析。氯霉素類藥物的測定方法主要有氣相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]等，其中超高效串聯(lián)質(zhì)譜法具有分析速度快和靈敏度高的特點(diǎn)。本研究在QuECHERS方法的基礎(chǔ)上，對提取溶液種類和凈化劑含量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合UPLC-MS/MS測定，建立了一種快速、有效、簡便的測定雞蛋中氯霉素類藥物的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：MixOne數(shù)顯渦旋振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（日本Hitachi Limited公司）；FSH-2可調(diào)高速電動勻漿機(jī)（上海天由儀器科技有限公司）；Milli-Q超純水凈儀（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（浙江納德科學(xué)儀器有限公司）；Waters XEVO MS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

試劑：氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液 （100 μg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙腈、甲酸和甲醇（HPLC級，美國德國MERCK公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水；十八烷基鍵合硅膠填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美國Agilent公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配制成濃度為2.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白提取液稀釋成濃度為0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.04 μg/mL、 0.08 μg/mL和0.10 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動相（甲醇∶水=10%∶90%）稀釋成濃度梯度為同系列濃度的溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取雞蛋樣品2.00 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速勻漿，靜置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振蕩3 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min離心 10 min，取上清液于5 mL離心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18進(jìn)行凈化，10 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜后，UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫 程 序：0～3 min，20% B；3～5 min，80% B；5～ 8 min，100% B；8～10 min，10% B。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）；負(fù)離子模式掃描（氟苯尼考胺為正離子模式）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：3.5 kV，離子源和離子化溶劑溫度分別為150 ℃和500 ℃，離子化和錐孔氣體流量分別為1 000 L/h和50 L/h。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了6種提取溶劑的提取效果，分別為90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。結(jié)果表明，含有甲醇組的提取液色素干擾嚴(yán)重，蛋白沉淀效果差，影響目標(biāo)物提取，回收率均在60%以下。乙腈組織滲透力和沉淀蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，本試驗(yàn)選取乙腈作為提取溶劑。提取劑中加入水的含量對目標(biāo)物氟苯尼考胺的提取有顯著影響，其中提取劑中含水量為10%和20%時(shí)，氟苯尼考胺回收率無差異，當(dāng)提取劑中含水量下降到30%時(shí)，氟苯尼考胺的回收率從90%下降為50%。為了減少有機(jī)溶劑乙腈的用量，節(jié)約成本，因此，選擇乙腈-水（8∶2，V/V）為提取溶劑，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008準(zhǔn)確度要求，該方法滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。

2.2 凈化劑的選擇

C18可以去除提取液中非極性物質(zhì)，降低干擾和減小基質(zhì)效應(yīng)，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；GCB可以消除色素對試驗(yàn)結(jié)果的干擾和質(zhì)譜離子化的影響。本文分別考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量對目標(biāo)物的影響。研究證明C18為20 mg，添加濃度為0.01 mg/kg時(shí)，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范圍在76.5%～108%。同時(shí)，當(dāng)在20 mg C18中加入 20 mg GCB時(shí)，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收范圍為75.6%～92.4%，為了節(jié)約成本和減少試驗(yàn)步驟，本研究選擇不加GCB。因此，本研究選擇凈化劑為C18，添加量為20 mg。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件選擇及優(yōu)化

在相同梯度洗脫條件下，考察了流動相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素的分離度、靈敏度和峰型的影響。試驗(yàn)表明，以乙腈水體系為流動相時(shí)，氟苯尼考胺保留時(shí)間小于 0.5 min；以甲醇水體系作為流動相時(shí)，氟苯尼考胺能有效保留，保留時(shí)間為1.27 min，本研究選擇洗脫能力弱的甲醇體系，圖1為氯霉素類藥物在甲醇體系的MRM色譜圖。

圖1 氯霉素類藥物的MRM色譜圖

氯霉素類藥物用甲醇配制成濃度為200 μg/L，質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行MS掃描，優(yōu)化毛細(xì)管電壓尋找母離子；優(yōu)化碰撞能量，選擇響應(yīng)高和干擾小的子離子作為定量離子。電離模式、定量離子對、定性離子對、碰撞能量及錐孔電壓見表1。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

配制基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測。在0.010～0.100 μg/mL范圍內(nèi)溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.991。以定量離子的信噪比S/N=3和S/N=10分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯霉素類化合物在雞蛋基質(zhì)中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.505～0.750 μg/kg和1.683～2.500 μg/kg，結(jié)果見 表2。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)

在UPLC-MS/MS檢測復(fù)雜樣品時(shí)，易受樣品基質(zhì)的干擾，影響目標(biāo)物的離子化，產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，稱為基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）[7]?；|(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小；比值在0.8～1.2范圍內(nèi)，則表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。基質(zhì)效應(yīng)見表2，除氟苯尼考胺外，氯霉素和氟甲砜霉素在雞蛋中基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，因此采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 回收率與精密度

選擇空白雞蛋樣品，在0.01 mg/kg添加水平下，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，氯霉素類藥物在雞蛋基質(zhì)中的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加標(biāo)回收率范圍在76.5%～108.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍在5.33%～6.01%，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[8]。

表3 氯霉素類藥物在雞蛋基質(zhì)中的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測定

隨機(jī)選取超市和養(yǎng)殖場的動物源性食品，包括超市雞蛋12份和養(yǎng)殖場21份，共33份樣品，運(yùn)用所建立的方法對樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)做方法對比，運(yùn)用國標(biāo)方法《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）[9]。結(jié)果顯示，所測的33份雞蛋樣品均未檢出氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素。

3 結(jié)論

本文利用QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，建立了雞蛋樣品基質(zhì)中氯霉素獸藥殘留的測定方法。該方法快速、簡便、靈敏，能夠?qū)悠分械哪繕?biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，采用基質(zhì)匹配校正曲線定量，能最大程度地消除基質(zhì)干擾，使檢測結(jié)果更加精確，適用于動物源性食品雞蛋中獸藥殘留的快速檢測。