李 健 梁玉娜

泰安市中心醫(yī)院乳腺疾病診療部，山東泰安 271000

乳腺癌現(xiàn)在已經(jīng)成為女性最常見的癌癥。根據(jù)Lancet最新的乳腺癌研究綜述，乳腺癌的發(fā)病率占世界女性癌癥的30%，死亡率與發(fā)病率的比值為15%［1］。根據(jù)以往的研究表明，病理分期對于乳腺癌患者的預(yù)后有很大的影響。乳腺癌是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的腫瘤，主要分為4種分子類型：lumial A型、lumial B型、Her-2陽性和三陰性亞型，對乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的預(yù)測價(jià)值［2］，但對于同一分子類型以及病理分期的患者，有時(shí)預(yù)后仍有非常大的差異。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，近年來越來越多的研究表明，雖然多種mRNA、miRNA、lncRNA、ceRNA等基因標(biāo)志物對乳腺癌的預(yù)后有著良好的預(yù)測作用［3-5］，然而，對于乳腺癌的診斷和治療仍然缺乏特異的、敏感的生物標(biāo)志物。蛋白表達(dá)在腫瘤發(fā)生的不同階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但目前還沒有關(guān)于乳腺癌的蛋白預(yù)后模型研究。蛋白質(zhì)水平的研究比RNA水平的研究更有利于臨床應(yīng)用，基于此，本研究擬從蛋白質(zhì)水平來分析乳腺癌，并且從蛋白質(zhì)角度來構(gòu)建多種蛋白質(zhì)聯(lián)合預(yù)后模型，以期為乳腺癌的臨床診斷、治療及預(yù)后的準(zhǔn)確性提供重要的參考資料。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

乳腺癌患者的蛋白質(zhì)表達(dá)譜和匹配的臨床信息從癌癥蛋白質(zhì)組圖譜門戶（TCPA）［6］（https://www.tcpaportal.org/tcpa/，包括879個(gè)乳腺癌樣本和224個(gè)蛋白質(zhì)）和TCGA網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov/，包括901個(gè)臨床病例信息）分別下載。TCPA是一個(gè)綜合資源，用于訪問、可視化和分析患者腫瘤樣本和癌細(xì)胞系的功能蛋白質(zhì)組學(xué)。本研究中所有數(shù)據(jù)均為上述官網(wǎng)來源的最新數(shù)據(jù)。從網(wǎng)站下載Perl軟件（https://www.perl.org/）［7］和R軟 件（https://www.rproject.org/）［8］。R軟件中的impute包用于填充缺失的數(shù)據(jù)。本研究符合TCPA的出版指南。

1.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)預(yù)測模型并進(jìn)行生存分析

用Perl軟件來整合蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)與患者生存數(shù)據(jù)，用R軟件survival包進(jìn)行單因素Cox分析，按照P＜0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的蛋白，再用R軟件ggplot2和ggrepel包繪制火山圖以可視化結(jié)果；然后，用lasso回歸去除預(yù)后相關(guān)蛋白的多重共線性，以防止模型基因之間的過度擬合；最后，對預(yù)后相關(guān)蛋白進(jìn)行多因素Cox分析，篩選出與乳腺癌有關(guān)的預(yù)后相關(guān)蛋白，構(gòu)建預(yù)測模型并用風(fēng)險(xiǎn)評分顯示。風(fēng)險(xiǎn)評分=（蛋白1的系數(shù)×蛋白1的表達(dá)）+（蛋白2的系數(shù)×蛋白2的表達(dá)）+…+（蛋白n的系數(shù)×蛋白n的表達(dá)）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)值的中位值將患者分為高危組和低危組，并對風(fēng)險(xiǎn)評分的生存率進(jìn)行分析，最后，繪制生存曲線來可視化結(jié)果。

1.3 預(yù)測模型中的蛋白評估

利用R軟件survival包對模型中的蛋白進(jìn)行生存曲線繪制，用pheatmap包對樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評分排序，然后，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分和蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)來繪制風(fēng)險(xiǎn)熱圖，用來分析模型蛋白在高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)評分中的表達(dá)情況；繪制風(fēng)險(xiǎn)評分和患者評分的風(fēng)險(xiǎn)曲線，用來評價(jià)預(yù)測模型在評估患者生存風(fēng)險(xiǎn)中的作用；繪制風(fēng)險(xiǎn)評分和生存狀態(tài)的生存狀態(tài)圖，用來評估模型對患者生存和預(yù)后的預(yù)測效果。

1.4 預(yù)測模型的性能評估

結(jié)合Perl軟件對樣本的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、風(fēng)險(xiǎn)值、年齡、分期等進(jìn)行組合，然后進(jìn)行單變量和多變量Cox分析，觀察上述臨床狀態(tài)、風(fēng)險(xiǎn)值和生存狀態(tài)之間的相關(guān)性，評價(jià)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型評分在預(yù)后預(yù)測中的作用，結(jié)果用可視化的森林圖展示。建立預(yù)測列線圖。列線圖通常用于預(yù)測癌癥的預(yù)后，將統(tǒng)計(jì)預(yù)測模型簡化為根據(jù)個(gè)體患者的狀況對事件（例如復(fù)發(fā)或死亡）的概率進(jìn)行單一數(shù)值評估。通過R軟件中的survival ROC包，繪制受試者操作特征（ROC）曲線，計(jì)算AUC值，評估乳腺癌患者預(yù)后模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.5 共表達(dá)蛋白分析

將預(yù)測模型中的蛋白質(zhì)和乳腺癌相關(guān)的223個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)數(shù)據(jù)作為輸入數(shù)據(jù)，用R軟件進(jìn)行相關(guān)分析，采用相關(guān)系數(shù)cor＞0.4和P＜0.001作為篩選條件對結(jié)果進(jìn)行篩選。使用R軟件中的ggalluvial、ggplot2和dplyr包構(gòu)建相關(guān)共表達(dá)蛋白的桑基圖。

1.6 差異表達(dá)分析

UALCAN是一個(gè)用戶友好的交互式網(wǎng)絡(luò)資源，包含了根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中31種癌癥類型的3級RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)分析癌癥OMICS數(shù)據(jù)。在UALCAN網(wǎng)站（http：//ualcan.path.uab.edu/）［23］上分析6個(gè)中樞蛋白及其編碼基因的差異表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在R軟件（R 4.0.2）或Perl軟件Strawberry Perl（64位）中，分析從TCPA和TCGA數(shù)據(jù)集檢索得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)和臨床信息。所有統(tǒng)計(jì)分析均通過R軟件進(jìn)行評估。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)預(yù)測模型的構(gòu)建

TCPA數(shù)據(jù)庫已將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為可識別的格式。首先基于單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析與總生存期（OS）相關(guān)的候選蛋白質(zhì)，P值低于0.05的蛋白質(zhì)被定義為顯著。HR＜1的蛋白質(zhì)被定義為候選保護(hù)性蛋白質(zhì)，HR≥1的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是候選危險(xiǎn)蛋白質(zhì)。用R軟件ggplot2和ggrepel包繪制火山圖進(jìn)行可視化（圖1A）；構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)特征模型。通過lasso回歸篩選出12種蛋白質(zhì)來去除共線性（圖1B，C）；多因素Cox分析共篩選出6種蛋白，可作為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（CASPASE7-CLEAVEDD198、NFKBP65_pS536、PCADHERIN、P27、X4EBP1_pT70、EIF4G）。預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)特征是通過組合6種中樞蛋白的表達(dá)值而構(gòu)建的，這些值由其回歸系數(shù)加權(quán)。將中位風(fēng)險(xiǎn)評分作為臨界值，將乳腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。

圖1 預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)及l(fā)asso回歸分析（紅色表示高風(fēng)險(xiǎn)蛋白質(zhì)，綠色表示低風(fēng)險(xiǎn)蛋白質(zhì)）

2.2 預(yù)測模型中的蛋白評估

通過對6種模型蛋白的生存分析，發(fā)現(xiàn)CASPASE7-CLEAVEDD198、PCADHERIN和P27蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后良好（P＜0.05），可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌作用（圖2A、B、C）。NFKBP65_pS536、X4EBP1_pT70和EIF4G蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后較差（P＜0.05），可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的促癌因素（圖2D、E、F）。通過預(yù)測模型風(fēng)險(xiǎn)評分的生存率分析發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組的總體生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.001）。驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)熱圖顯示，蛋白CASPASE7-CLEAVEDD198、PCADHERIN和P27在高危組中較低，NFKBP65_pS 536、X4EBP1_pT70和EIF4G在高危組中較高，這與生存分析結(jié)果具有相同的趨勢（圖3C）。風(fēng)險(xiǎn)曲線顯示，隨著患者生存風(fēng)險(xiǎn)評分的增加，模型風(fēng)險(xiǎn)評分相應(yīng)增加（圖3A）。生存狀態(tài)圖顯示患者的生存率隨著生存風(fēng)險(xiǎn)評分的增加而降低（圖3B）。

圖2 6種預(yù)測模型蛋白的生存分析

圖3 乳腺癌組的詳細(xì)預(yù)后模型信息

2.3 預(yù)測模型預(yù)測性能驗(yàn)證

我們進(jìn)一步評估了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的性能。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分分為兩組后，高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組在OS上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。單因素（圖5A）和多因素（圖5B）Cox回歸分析顯示，患者年齡和預(yù)測模型是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；預(yù)測列線圖是通過涉及臨床病理學(xué)和預(yù)后模型構(gòu)建的。預(yù)后模型和臨床病理數(shù)據(jù)的使用可以提高3年、5年和10年OS預(yù)測的敏感性和特異性（圖6）。ROC分析可以檢驗(yàn)預(yù)測模型評價(jià)患者預(yù)后的準(zhǔn)確性和敏感性（圖7），通過ROC分析預(yù)測模型的風(fēng)險(xiǎn)評分和臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)預(yù)測模型比傳統(tǒng)的臨床病理對乳腺癌患者的預(yù)后評估具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性。

圖4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型驗(yàn)證（高低風(fēng)險(xiǎn)組OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

圖5 臨床病理參數(shù)和風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后意義

圖6 使用臨床病理數(shù)據(jù)和預(yù)后模型構(gòu)建的列線圖

圖7 風(fēng)險(xiǎn)特征的預(yù)測準(zhǔn)確性（ROC曲線）

2.4 6個(gè)Hub蛋白的差異表達(dá)分析

與正常樣本相比，4EBP1、CASP7、CDKN1B和EIF4G1的mRNA在原發(fā)性腫瘤中的表達(dá)顯著增加，而NFKB1和CDH3的表達(dá)顯著降低。同樣的，在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CASP7、CDH3和EIF4G1的表達(dá)顯著增加，而NFKB1的表達(dá)顯著降低（圖8，9）。

圖8 乳腺癌組織和正常組織（UALCAN）之間6種編碼基因的表達(dá)（*P＜0.05）

2.5 蛋白質(zhì)相關(guān)性分析

根據(jù)蛋白質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，蛋白CASPASE7CLEAVEDD198、PCADHERIN、X4EBP1_pT70和EIF4G與其他蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的相關(guān)性，尤其是EIF4G，它的相關(guān)蛋白數(shù)量最多。對相關(guān)蛋白的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，它們其中大多數(shù)作為促癌蛋白，參與癌癥發(fā)生、PD-L1表達(dá)與PD-1檢查點(diǎn)通路、ErbB和mTOR信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其中CASPASE7CLEAVEDD198蛋白與癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，PCADHERIN與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，X4EBP1和EIF4G與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率較高，發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，并且仍然缺乏有效的治療方法［9］。目前，雖然對乳腺癌的診斷和治療有很多的研究，但都沒有取得重大突破。因此，尋找一種可靠的預(yù)測乳腺癌預(yù)后的方法，對及時(shí)、準(zhǔn)確地預(yù)測治療效果，指導(dǎo)進(jìn)一步治療具有重要的意義。

在本研究中，通過對TCPA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌相關(guān)蛋白進(jìn)行分析，構(gòu)建了一個(gè)包含6種蛋白質(zhì)的預(yù)測模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該預(yù)測模型能有效預(yù)測生存率，而高危組總生存率較低危組差。獨(dú)立預(yù)后及ROC分析表明，該預(yù)測模型可作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對患者預(yù)后有較好的預(yù)測價(jià)值。Ualcan數(shù)據(jù)庫分析表明CASP7、EIF4G1在乳腺癌組織中顯著過表達(dá)，而NFKB1在結(jié)直腸癌組織中顯著低表達(dá)。CDH3的mRNA表達(dá)與其蛋白表達(dá)不匹配。此外，通過蛋白質(zhì)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CASPASE7CLEAVEDD19 8、PCADHERIN、X4EBP1_pT70和EIF4G是調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵蛋白。

CASPASE7是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（半胱氨酸酶）家族的一員。SREBP1通過抑制CASPASE7的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對5-Fu的抵抗［10］。在內(nèi)分泌抵抗的乳腺癌細(xì)胞中，ERα的缺失通過降低ERα介導(dǎo)的CASPASE7的表達(dá)而影響HDAC3的穩(wěn)定，從而導(dǎo)致CASPASE7介導(dǎo)的HDAC3裂解的減少［11］。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，ERα-HDAC3軸決定了H3K9和H4K16乙?；恼w狀態(tài)，這與ERα的表達(dá)呈正相關(guān)。

P-cadherin是細(xì)胞間粘附分子cadherin家族的一員，P-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)與患者的生存率密切相關(guān)，是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子。P-cadherin是比E-cadherin、N-cadherin和其他細(xì)胞粘附分子更好的臨床預(yù)后指標(biāo)［12-13］。本研究還發(fā)現(xiàn)Pcadherin的異常表達(dá)（高）與乳腺癌患者的生存率降低有關(guān)。

4EBP1是細(xì)胞mTOR信號通路的主要影響因子，它的基因擴(kuò)增狀態(tài)可用于預(yù)測乳腺癌的預(yù)后以及不同亞型乳腺癌中抗雌激素治療的有效性［14］。

研究發(fā)現(xiàn)，NFKBP65_pS536（自噬相關(guān)蛋白NFKB p65）與高組織學(xué)分級（P=0.05）、雌激素受體（ER）陰性（P=0.01）和高Ki67指數(shù)（P=0.002）相關(guān)，核NF-κB染色患者的病理完全反應(yīng)（PCR）率高于未染色患者（分別為26.5%和6.0%，P=0.004）［15］。

圖9 乳腺癌組織和正常組織（UALCAN）之間6種關(guān)鍵蛋白的表達(dá)（*P＜0.05）

圖10 TCPA數(shù)據(jù)庫中與6個(gè)中樞蛋白相關(guān)的所有蛋白質(zhì)的桑基圖（R＞0.4，P＜0.001）

EIF4G是真核翻譯起始因子4F（eIF4F）復(fù)合物的支架成分，主要參與蛋白質(zhì)合成的起始，eIF4G的兩個(gè)亞型（eIF4G1和eIF4G2）與各種腫瘤密切相關(guān)。Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，eIF4G1在乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌、肺鱗癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)；eIF4G2在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和急性髓系白血病中明顯高表達(dá)，而在膀胱移行細(xì)胞癌中低表達(dá)。

P27是從G1到S期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［17］。細(xì)胞周期抑制劑P27是小型（T1a、b）浸潤性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物［18］。

在這項(xiàng)研究中，我們還鑒定了與預(yù)后特征蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們的研究也存在一些不足。首先，TCPA數(shù)據(jù)庫中僅鑒定了200多種蛋白質(zhì)，缺乏許多關(guān)鍵蛋白質(zhì)的信息；其次，缺乏外部驗(yàn)證導(dǎo)致我們的研究結(jié)果臨床應(yīng)用價(jià)值有限，需要進(jìn)一步研究其外部驗(yàn)證和臨床實(shí)用性；最后，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對于闡明蛋白質(zhì)組學(xué)特征的潛在分子機(jī)制是必要的。總之，我們的研究已經(jīng)建立并驗(yàn)證了基于蛋白質(zhì)的乳腺癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，這有助于為乳腺癌患者更個(gè)性化的治療提供經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突