鄺良德，董宜萱，李叢艷*，郭志強(qiáng)，任永軍，鄭 潔，梅秀麗，楊 銳，謝曉紅，雷 岷

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中，畜禽易受多種因素影響發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)并對畜牧生產(chǎn)有很大負(fù)面影響，尤其以夏季熱應(yīng)激最為常見。西南地區(qū)夏季高溫高濕，極端氣溫可高達(dá)38℃以上，而肉兔全身被毛，汗腺功能不發(fā)達(dá)，體溫調(diào)節(jié)能力差，極易產(chǎn)生熱應(yīng)激，從而影響其繁殖性能、生長性能以及免疫功能等[1-4]。齊興肉兔是四川省畜牧科學(xué)研究院通過雜交培育而成的中型肉兔，具有繁殖力高、耐粗飼、耐熱性好、抗病能力強(qiáng)、配套利用優(yōu)勢明顯等優(yōu)點，被廣大兔養(yǎng)殖戶作為首選母系兔[5]。不同品種或個體間耐熱性能差別較大，遺傳因素對動物耐熱性起重要作用[6]。為減少夏季熱應(yīng)激對養(yǎng)兔業(yè)造成的損失，通過選擇耐熱性好的個體培育耐熱新品種具有非常重要的現(xiàn)實意義。

目前，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)飛速發(fā)展，采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）標(biāo)記蛋白組學(xué)已經(jīng)成為一種探索動物生長發(fā)育、疾病發(fā)生等生物學(xué)過程的有力技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)性狀調(diào)控機(jī)制研究中[7]。Wang 等[8]通過TMT 標(biāo)記蛋白組技術(shù)研究綿羊胚胎骨骼肌發(fā)育過程中的差異表達(dá)蛋白，共鑒定到1 316 個差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)一步分析了這些差異蛋白的功能和作用。Ferreira 等[9]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究綿羊在發(fā)生季節(jié)性體重減輕時肌肉蛋白質(zhì)的變化，鑒定到7 個與季節(jié)性體重減輕耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)。Zhang 等[10]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究牛對無乳鏈球菌引起的乳腺炎的免疫反應(yīng)，為預(yù)防和靶向治療牛乳腺炎提供了候選基因或蛋白質(zhì)。Zheng 等[11]利用TMT 標(biāo)記蛋白組技術(shù)研究泌乳高峰期和泌乳晚期的牛乳腺組織中差異表達(dá)蛋白，共篩選到179 個差異表達(dá)蛋白，其中14 個差異蛋白與泌乳性能和乳腺形態(tài)有關(guān)。而TMT 蛋白組學(xué)技術(shù)在家兔上的應(yīng)用研究還未見報道。本實驗擬利用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究熱應(yīng)激對齊興肉兔母兔卵巢組織中蛋白表達(dá)影響，篩選與熱應(yīng)激反應(yīng)、繁殖相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，為選育耐熱性好的新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗于2019 年6—8 月在四川省畜牧科學(xué)研究院肉兔科研基地進(jìn)行。選擇200 只健康齊興肉兔初產(chǎn)母兔，隨機(jī)分為適溫組和熱應(yīng)激組，每個處理100只兔，分別飼養(yǎng)在2 個環(huán)控兔舍中（單層金屬兔籠）。其中適溫組采用空調(diào)降溫，人工加濕，環(huán)境溫度為（21±1）℃；熱應(yīng)激組采用電暖風(fēng)加熱，人工加濕，環(huán)境溫度為（32±1）℃。實驗前對兔舍進(jìn)行徹底消毒，實驗期間自由采食、飲水，除溫度外，其他各環(huán)境因素保持一致。適應(yīng)期2 周，正試期為母兔配種至第1 胎仔兔斷奶（28 日齡斷奶），所有試驗?zāi)竿镁谕惶爝M(jìn)行配種，飼養(yǎng)管理條件一致（日糧主要營養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)18.12%、粗纖維14.53%、消化能10.70 MJ/kg）。正式實驗結(jié)束后，分別從適溫組和熱應(yīng)激組隨機(jī)抽取齊興肉兔母兔各3 只進(jìn)行屠宰，適溫組與熱應(yīng)激組交替屠宰，取1 cm3左右（約2 g）的卵巢組織樣品迅速放入液氮，用于蛋白質(zhì)組鑒定分析。

1.2 主要儀器和試劑Q Exactive 質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher）、臺式冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、高pH 分離液相色譜儀（日本Agilent）、凍干機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher）、SDS-PAGE 凝膠電泳儀（美國Bio-rad）、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、ImageScanner 掃描儀（美國GE Healthcare）、TMT 標(biāo)記試劑盒（美國ThermoFisher）、羥胺（美國Sigma-aldrich）、胰酶（北京華利世科技有限公司）、甲酸（上海CNW）、PMSF（美國Amresco）、BCA 試劑盒（美國ThermoScientific）、SDS 裂解液（北京百奧萊博科技有限公司）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（Iodacetamide，IAA）、三乙基碳酸氫銨緩沖 液（Triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB）均為美國sigma-aldrich 公司產(chǎn)品。

1.3 環(huán)境THI 指數(shù)測定 在全環(huán)控兔舍中部距地面15 cm處掛置Apresys 179-TH 溫濕度記錄儀，設(shè)10 min 為間隔記錄試驗期間溫度和濕度，利用Marai 等[3]提出的THI 公式計算環(huán)境THI 指數(shù)：THI=db－[（0.31-0.31RH）（db－14.4）]，db、RH 分別表示溫度計數(shù)值（℃）、相對濕度（%）。

1.4 樣品的制備 稱取100 mg 卵巢組織樣品放于1.5 mL離心管中，加入400 μL SDS 裂解液，然后加入4 μL 蛋白酶抑制劑（PMSF），置于冰上采用勻漿機(jī)破碎；4℃，12 000×g 離心10 min 去除泡沫，冰上超聲破碎3 min（超聲1.0 s，關(guān)閉1.0 s）；將溶液在室溫下 12 000×g 離心15 min，取上清液并再次離心取上清，然后采用試劑盒測定蛋白濃度，分裝后儲存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SDS-PAGE 電泳每個樣品取10 μg，采用12 %SDS-PAGE 進(jìn)行分離，然后采用考馬斯亮蘭染色法進(jìn)行染色，利用ImageScanner 掃描儀對染色后的凝膠進(jìn)行掃描，掃描模式設(shè)置為全彩模式，光密度值為300 dpi。

1.6 胰蛋白酶酶解 參考FASP[12]方法酶解蛋白：蛋白定量后的樣品每個取100 μg 置于超濾管中，取120 μL 還原劑緩沖液（10 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，100 mmol/L TEAB，pH 8.0），60℃反應(yīng)1 h；加入IAA 至終濃度為50 mmol/L，室溫避光反應(yīng)40 min；4℃，12 000 r/min 離心20 min，收集管底部溶液；加入100 μL 300 mmol/L TEAB 緩沖液，12 000 r/min 離心20 min，2 次；更換新收集管，在超濾管中加入200 μL 300 mmol/L TEAB緩沖液，并加入3 μL 測序級胰蛋白酶液（1 μg/μL），37℃反應(yīng)12 h；12 000 r/min 離心20 min，收集酶解后肽段，在超濾管中再加入50 μL 200 mmol/L TEAB 緩沖液，12 000 r/min 離心20 min，收集管底溶液并凍干。

1.7 肽段標(biāo)記 向凍干樣品中加入100 μL 200 mmol/L TEAB 緩沖液后渦流混勻，取出40 μL 樣品于1.5 mL Ep管中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)；從冰箱中取出TMT 試劑，平衡到室溫，加入88 μL 無水乙腈，渦流5 min，離心；取41 μL TMT 試劑加到樣品中，渦流混勻，室溫放置1 h；加入8 μL 5%羥胺終止反應(yīng)15 min，凍干后于-80℃保存。

1.8 反相色譜分離 將凍干的標(biāo)記后樣品用流動相A復(fù)溶（總體積控制在120 μL），充分渦旋振蕩，室溫12 000 r/min 離心5 min。然后進(jìn)行高pH 液相色譜分離，收集8～60 min 的樣品，依次每隔1 min 收集洗脫液到1～15 號離心管中，然后按照1→15 反復(fù)收樣。樣品收集好后真空冷凍干燥抽干，冷凍保存待上質(zhì)譜。

1.9 串聯(lián)質(zhì)譜分析 肽段粉末用A 相（0.1%的甲酸水）復(fù)溶，然后上樣到預(yù)柱Acclaim PepMap100（RP-C18，Thermo Fisher），再經(jīng)分析柱Acclaim PepMap RSLC（RP-C18，Thermo Fisher）分離。分離后樣品用Q Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜掃描設(shè)定為全掃描荷質(zhì)比m/z 范圍300～1 650，并對其中15 個最高峰進(jìn)行MS/MS 掃描；所有MS/MS 圖譜采集使用數(shù)據(jù)依賴型的正離子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量設(shè)為35；MS/MS 的分辨率設(shè)為60 000，自動增益控制設(shè)為2e5，離子最大注射時間為120 ms；動態(tài)排除時間設(shè)為30 s。利用軟件Thermo Xcalibur 4.0（Thermo，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，然后使用軟件Proteome Discover（Thermo fisher）進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。

1.10 蛋白質(zhì)鑒定及生物信息學(xué)分析 利用數(shù)據(jù)庫檢索得到原始數(shù)據(jù)后，按照Score Sequest HT＞0 且unique peptide ≥1，并去除空白值的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白。在可信蛋白基礎(chǔ)上，根據(jù)篩選條件：FC（Fold change）≥1.3 或≤0.78，且P＜0.05 進(jìn)行差異蛋白篩選。使用Blast2GO 軟件對鑒定的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體（GO）分析，分別從3 個方面描述差異蛋白質(zhì)的屬性：包括參與的生物過程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）。然后，將鑒定到的差異蛋白質(zhì)通過http://www.uniprot.org/uploadlists/ 進(jìn)行在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，導(dǎo)出FASTA 文件，再將其進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析，確定差異蛋白質(zhì)參與的最主要的代謝通路。為得到差異蛋白之間的相互作用關(guān)系，利用STRING軟件構(gòu)建差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔舍溫濕指數(shù)的測定結(jié)果 家兔熱應(yīng)激分為4 個等級：THI＜27.8 時為無熱應(yīng)激；THI 在27.8～28.9 為中等熱應(yīng)激；THI 在28.9～30.0 為嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激；THI＞30 時為特別嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激[4]。如圖1 所示，適溫組每日平均THI指數(shù)均低于27.8，表明該組母兔整個實驗期均處于無熱應(yīng)激狀態(tài)；熱應(yīng)激組每日平均THI 指數(shù)均高于30，由此判斷實驗期間該組母兔處于特別嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激狀態(tài)。

圖1 實驗期間不同兔舍溫濕指數(shù)日變化曲線

2.2 齊興肉兔卵巢組織蛋白SDS-PAGE 結(jié)果 如圖2 所示，適溫組和熱應(yīng)激組蛋白質(zhì)條帶清晰豐富，分布均勻，且重復(fù)性好，可以滿足下一步TMT 標(biāo)記蛋白組學(xué)實驗分析。

圖2 齊興肉兔卵巢組織蛋白SDS-PAGE 電泳圖

2.3 齊興肉兔卵巢組織差異蛋白篩選結(jié)果 齊興肉兔卵巢組織蛋白樣品經(jīng)過LC-MS/MS 檢測，搜庫比對后，共鑒定出5 001 個蛋白質(zhì)。根據(jù)篩選條件，以適溫組作為對照，在熱應(yīng)激組中共篩選出270 個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白68 個，下調(diào)蛋白202 個（圖3）。

圖3 差異蛋白數(shù)目統(tǒng)計圖

2.4 齊興肉兔卵巢組織差異蛋白聚類分析 如圖4 所示，熱應(yīng)激組與適溫組中上、下調(diào)表達(dá)的差異蛋白分別聚類在一起。

圖4 差異蛋白聚類分析圖

2.5 齊興肉兔卵巢組織差異蛋白GO 富集分析 如圖5所示，差異蛋白主要富集到核小體定位組裝、RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、上皮細(xì)胞分化等生物學(xué)過程中，其中上皮細(xì)胞分化（Epithelial Cell Differentiation）所占比例最高；就細(xì)胞組分而言，差異蛋白主要分布在外泌體、細(xì)胞膜和細(xì)胞核等，其中外泌體（Extracellular Exosome）所占比例最高；在分子功能分類中，差異蛋白主要參與結(jié)合活性、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能，其中結(jié)構(gòu)分子活性（Structural Molecule Activity）所占比例最高。

圖5 差異蛋白GO 富集分析

2.6 齊興肉兔卵巢組織差異蛋白KEGG 富集分析 如圖6 所示，差異蛋白最顯著富集的代謝通路是生熱作用，其次為氧化磷酸化、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、PPAR信號通路、鐵死亡、心臟肌肉收縮、維生素消化吸收等代謝通路。

圖6 差異蛋白KEGG 富集分析

2.7 齊興肉兔卵巢組織差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析 如圖7所示，差異蛋白顯著富集的功能模塊主要為膽固醇代謝、PPAR 信號通路、氧化磷酸化、脂肪酸代謝、生熱作用、維生素消化吸收等通路，這與KEGG 富集分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明這些代謝通路在熱應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用。在網(wǎng)絡(luò)互作圖中，每個功能模塊有多個功能節(jié)點，每個功能節(jié)點代表1 個差異蛋白，通路重合點多的節(jié)點就為核心差異蛋白。由表2 可知，本實驗中涉及到的核心差異蛋白有10 種，有2 種上調(diào)的差異蛋白與氧化磷酸化有關(guān)，分別是過氧化氫酶（CAT）和載脂蛋白B（APOB）。有5 種下調(diào)的差異蛋白與膽固醇代謝有關(guān)，分別是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、載脂蛋白A1（APOA1）、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4）、電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）、窖蛋白（CAV1）。有5 種下調(diào)的差異蛋白與脂肪酸代謝有關(guān)，分別是HMGCR、APOA1、琥珀酸脫氫酶細(xì)胞色素b560 亞基（SDHC）、FABP4、CAV1。有3 種下調(diào)的差異蛋白與氧化磷酸化有關(guān)，分別是APOA1、SDHC、VDAC1。有2 種下調(diào)的差異蛋白與PPAR 信號通路有關(guān)，分別是APOA1、FABP4。有1 種下調(diào)的差異蛋白APOA1 與維生素消化吸收有關(guān)。

表2 熱應(yīng)激組和適溫組卵巢組織核心差異蛋白

圖7 差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

3 討論

熱應(yīng)激會對母兔繁殖性能產(chǎn)生不利影響，特別是會降低母兔的受胎率、采食量和斷奶仔兔數(shù)[13]，但是對于其內(nèi)在機(jī)制方面的相關(guān)研究未見報道。本研究利用TMT 蛋白組技術(shù)在齊興肉兔母兔卵巢組織中篩選得到與熱應(yīng)激和卵泡發(fā)育相關(guān)的差異蛋白，并進(jìn)一步進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過KEGG 注釋和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，主要分析了差異蛋白主要富集的脂肪酸代謝通路、膽固醇代謝通路。

在脂肪酸代謝通路中，脂肪酸可為機(jī)體提供能量，還原型輔酶II（NADPH）是脂肪酸的合成的輔酶，NADPH 主要來源是磷酸戊糖途徑，關(guān)鍵酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶。Rinaldo 等[14]研究表明，熱應(yīng)激會降低6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，從而降低NADPH 活性抑制脂肪酸的合成。SDHC 是三羧酸循環(huán)和線粒體有氧呼吸鏈的關(guān)鍵酶復(fù)合物，其由4 個蛋白質(zhì)亞基（SDHA、SDHB、SDHC和SDHD）組成[15]。本實驗中熱應(yīng)激條件下，SDHC 含量顯著下調(diào)會導(dǎo)致NADPH 活性降低，從而影響脂肪酸合成。下調(diào)的FABP4 是一種細(xì)胞質(zhì)脂肪酸伴侶，主要在脂肪細(xì)胞和髓樣細(xì)胞中表達(dá)，研究證明FABP4 會觸發(fā)過氧化物酶增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）的泛素化和隨后的蛋白酶體降解，而PPAR-γ是脂肪生成和胰島素反應(yīng)性的主要調(diào)節(jié)劑，PPAR-γ基因表達(dá)可顯著影響脂肪細(xì)胞的增殖與分化[16-17]。本實驗中顯著下調(diào)的FABP4使PPAR-γ活性降低，可顯著影響脂肪生成代謝。另一方面，VDAC1 是一種多功能的線粒體外膜蛋白，起到線粒體調(diào)控器的作用，控制代謝產(chǎn)物在線粒體內(nèi)外的運(yùn)輸和能量產(chǎn)生，不僅影響機(jī)體脂肪的合成，同時還能夠協(xié)調(diào)糖酵解和氧化磷酸化作用[18]，因此，本研究中熱應(yīng)激組母兔卵巢中SDHC、FABP4、VDAC1 蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，抑制了脂肪酸合成。

在膽固醇代謝通路中，膽固醇是所有細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器膜上的重要組成成分，膽固醇轉(zhuǎn)化為中性膽固醇酯，既可以存儲在脂質(zhì)小滴中，也可以分泌成脂蛋白，膽固醇的穩(wěn)態(tài)對于細(xì)胞和全身功能至關(guān)重要[19]。在膽固醇合成中關(guān)鍵限速酶是HMGCR，下調(diào)HMGCR 不僅僅對細(xì)胞有損傷，還可能導(dǎo)致動物機(jī)體無力[20]。本實驗結(jié)果表明，HMGCR 是熱應(yīng)激組母兔卵巢組織中顯著下調(diào)的核心差異蛋白，隨著HMGCR 下調(diào)，膽固醇合成速度受到影響，從而影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增值合成與修復(fù)，進(jìn)而影響母兔繁殖性能。卵巢是合成膽固醇的主要器官之一，高密度脂蛋白（HDL）受體能夠介導(dǎo)膽固醇選擇性攝取[21]，而APOA1 具有阻止HDL 與細(xì)胞膜融合的能力，在脂蛋白代謝中起著關(guān)鍵作用[22]。本實驗中熱應(yīng)激組母兔卵巢APOA1 蛋白顯著下調(diào)，將會降低卵巢膽固醇的合成。CAV1 是必不可少的膜蛋白[23]，CAV1 和膜膽固醇在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）彼此直接聯(lián)系且功能上相連，CAV1 介導(dǎo)可降低MSC 中膜膽固醇水平[24]。小鼠上的研究表明，CAV1 與卵巢早衰有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞囊腫分解和原始卵泡的形成[25]。本研究中熱應(yīng)激會下調(diào)HMGCR、APOA1 和CAV1 蛋白水平，從而導(dǎo)致膽固醇合成受阻礙，引起母兔卵巢早衰，影響母兔繁殖性能。

4 結(jié)論

本實驗利用TMT 蛋白組學(xué)技術(shù)篩選熱應(yīng)激條件下齊興肉兔母兔卵巢組織中差異表達(dá)蛋白，共篩選到10 種核心差異蛋白，其中下調(diào)的差異蛋白VDAC1、FABP4、TFRC、SDHC、APOA1、HMGCR 抑制了脂肪酸代謝通路、膽固醇代謝通路和氧化磷酸化通路，導(dǎo)致卵巢內(nèi)細(xì)胞膜的破壞和損傷，從而引起卵巢早衰，降低齊興肉兔母兔繁殖性能。