蔡孟成,張慧卿,謝 瑋,金永生

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 200433;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系,上海 200433;3.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)

平消膠囊是臨床常用的抗腫瘤中成藥，廣泛用于包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的各類常見惡性腫瘤的治療，其由《金匱要略》硝石礬石散增補(bǔ)而來，由硝石、礬石、馬錢子、郁金、枳殼、五靈脂、干漆、仙鶴草八味中藥構(gòu)成，具有活血散結(jié)、扶正解毒的功效，可緩解癌痛癥狀、縮小瘤體。近年來研究表明，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病率高居整體腫瘤的第三位，而平消膠囊對(duì)于提高患者生存質(zhì)量和延長生存期起到了積極作用，且其毒副作用輕微，可長期服用[1]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本文旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討平消膠囊治療結(jié)腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為腫瘤精準(zhǔn)治療提供新的治療選擇，并為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 藥物與疾病靶點(diǎn)的篩選 本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，網(wǎng)址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索中藥郁金、仙鶴草、枳殼、馬錢子的活性成分；TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄五靈脂、礬石、硝石、干漆四味中藥，故通過中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)檢索獲取收錄的四味中藥的活性成分，再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫得到對(duì)應(yīng)化合物的靶點(diǎn)。根據(jù)化合物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)與類藥性(drug-likeness,DL)進(jìn)行篩選，OB閾值設(shè)為OB≥30%，DL閾值設(shè)為DL≥0.18，并采用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)[2]。利用美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的醫(yī)學(xué)主題詞表(Medical Subject Headings,MeSH)檢索結(jié)腸癌(colon cancer)的主題詞，得到colonic neoplasm；再從Entry Terms選擇“colon cancer”、“cancer of colon”等疾病相關(guān)詞匯，再利用GeneCard數(shù)據(jù)庫獲取與結(jié)腸癌直接相關(guān)的靶點(diǎn)。檢索日期均為2020-10-22。

1.2 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 為明確疾病相關(guān)靶點(diǎn)與平消膠囊相關(guān)靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將上述兩部分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，輸入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 為更深層次探究靶點(diǎn)蛋白質(zhì)之間的相互作用，將統(tǒng)計(jì)所得的疾病-藥物靶點(diǎn)基因上傳至在線STRING10.5軟件(http://string db.org)，上傳時(shí)間為2020-10-24，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI)模型。物種選擇為人(homosapiens)，參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取PPI。

1.4 生物過程與通路分析 利用Cytoscape軟件中的ClueGo功能對(duì)藥物和疾病的公共靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，其中GO富集分析包括細(xì)胞組成(cellular component, CC)、生物過程(biological process, BP)以及分子功能(molecular function, MF)三個(gè)部分，保存結(jié)果。設(shè)定閾值P<0.05，將結(jié)果可視化。

1.5 分子對(duì)接 從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB，網(wǎng)址https://www.rcsb.org/)下載淀粉樣前體蛋白(APP)與雌激素受體1(ESR1)兩個(gè)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID為4LXM和4XI3，PDB格式)，從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載槲皮素、木犀草素和山奈酚的三維結(jié)構(gòu)(CAS號(hào)為117-39-5、491-70-3和520-18-3，PDB格式)，下載時(shí)間均為2020-10-29，采用Pymol-2.4.1刪除靶蛋白的配體，然后利用AutoDock Tools 1.5.6軟件刪除靶蛋白的水分子，添加非極性氫，計(jì)算Gasteiger電荷，保存為PDBQT格式的文件。將已經(jīng)保存為PDB格式的化合物導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)，保存為PDBQT格式，作為對(duì)接配體。運(yùn)行AutoGrid與AutoDock 進(jìn)行對(duì)接，并利用Pymol軟件將結(jié)果可視化。

2 結(jié) 果

2.1 篩選藥物活性成分 通過TCMSP檢索到郁金、仙鶴草、枳殼、馬錢子中化合物共342個(gè)活性成分，其中222個(gè)來自郁金、17個(gè)來自枳殼、62個(gè)來自馬錢子、41個(gè)來自仙鶴草。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18篩選出化合物38種，其中15個(gè)來自郁金、5個(gè)來自枳殼、13個(gè)來自馬錢子、5個(gè)來自仙鶴草。通過查閱TCMID數(shù)據(jù)庫獲取五靈脂中化合物共39個(gè)，干漆中化合物1個(gè)，礬石的主要成分為KAl(SO4)2·12H2O，硝石的主要成分為KNO3。將其逐個(gè)輸入TCMSP，按照上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共獲取3個(gè)化合物。去除重復(fù)化合物后共發(fā)現(xiàn)平消膠囊中活性物質(zhì)37個(gè)，可入血的活性成分20個(gè)，并獲取對(duì)應(yīng)的藥物成分靶點(diǎn)共113個(gè)，化合物見表1。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得21 151個(gè)與結(jié)腸癌直接相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.2 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)包含20個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、113個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和274條邊，用紅色菱形表示化合物，綠色圓形表示靶點(diǎn)，連接化合物與靶點(diǎn)的邊表示兩者之間有作用關(guān)系(見圖1)。

圖1 平消膠囊主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network diagram of main component-target of Pingxiao capsules

依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知， 有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或藥物靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵的作用，因此本研究篩選節(jié)點(diǎn)度較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析。排名前5位的化合物分別為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、川陳皮素(nobiletin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分別能與76、33、28、18、16和15個(gè)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)發(fā)生作用。從靶點(diǎn)的角度看，degree排名前5位的是前列腺素過氧化物合酶1(PTGS1)、核受體共活化劑2(NCOA2)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、毒蕈堿型膽堿受體 M1(CHRM1)、孕激素受體(PGR)，分別能與11、11、8、8和7個(gè)化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的特性。

2.3 平消膠囊靶點(diǎn)PPI的構(gòu)建與分析 應(yīng)用STRING軟件構(gòu)建PPI (見圖2)，在此網(wǎng)絡(luò)圖中包含95個(gè)節(jié)點(diǎn)，948條邊，同時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的頻次。根據(jù)“度值>均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)40個(gè)，前20個(gè)包括APP、ESR1、EGFR、RELA、FOS、CCND1、NCOA1、MAPK8、NR3C1、IL6、AR、APOB、CASP3、CASP8、CYP1A1、NCOA2、GSK3B、PRKCA、RB1、VEGFA。度值最高的是APP和ESR1(度值為32)，其次為EGFR和RELA(度值為30)。度值大的靶點(diǎn)提示在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可能是平消膠囊治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 GO富集與通路富集分析 GO生物過程條目主要包括：核受體活性、胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)的調(diào)節(jié)、胞內(nèi)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)以及在凋亡過程中半胱氨酸性肽鏈內(nèi)切酶的活性等。分子功能包括：乙酰膽堿受體活性、調(diào)節(jié)凋亡過程中半胱氨酸性肽鏈內(nèi)切酶的活性、RNA聚合酶Ⅱ-特定DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶催化劑活性以及跨膜受體蛋白酪氨酸酶活性；并且參與了細(xì)胞膜及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的組成。KEGG富集分析(見圖3)主要包括：腫瘤通路、糖尿病AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、ErbB信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路等通路。其中腫瘤通路占比最高(見圖4)。

圖3 平消膠囊干預(yù)結(jié)腸癌的KEGG富集分析圖Figure 3 KEGG enrichment diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

圖4 平消膠囊干預(yù)結(jié)腸癌的KEGG富集分析比例圖Figure 4 KEGG enrichment ratio diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

2.5 分子對(duì)接 一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。作者對(duì)平消膠囊中的槲皮素、木犀草素和山奈酚進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接模式見圖5。槲皮素與 4LXM和4XI3分子對(duì)接的結(jié)合能分別為-5.10和-5.44 kJ/mol；木犀草素與4LXM和4XI3分子對(duì)接的結(jié)合能分別為-5.04和-5.58 kJ/mol；山奈酚與4LXM和4XI3分子對(duì)接的結(jié)合能分別為-5.02和-5.87 kJ/mol。結(jié)果表明，木犀草素、槲皮素和山奈酚通過與APP蛋白和ESR1蛋白結(jié)合而產(chǎn)生干預(yù)結(jié)腸癌的作用。

圖5 平消膠囊主要活性成分與4LXM、4XI3分子對(duì)接模式Figure 5 Molecular docking model of 4LXM and 4XI3 with main components of Pingxiao capsulesA:槲皮素與4LXM分子對(duì)接；B：槲皮素與4XI3分子對(duì)接；C：木犀草素與4LXM分子對(duì)接；D：木犀草素與4XI3分子對(duì)接；E：山奈酚與4LXM分子對(duì)接；F：山奈酚與4XI3分子對(duì)接

3 討 論

小分子靶向藥物作為新型化療藥物可通過特異性阻斷腫瘤增殖生長過程中所必需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高抗癌療效。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素和山奈酚這些小分子化合物可能是平消膠囊抗結(jié)腸癌的主要化學(xué)成分。現(xiàn)代研究表明，槲皮素與靶向藥物一起使用可以避免靶向藥物產(chǎn)生耐藥性[3]，且能夠增強(qiáng)靶向藥物的療效，其機(jī)制可能是槲皮素通過抗氧化而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[4]。木犀草素也具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，其與ERK/FOXO3a依賴機(jī)制有關(guān)[5]。山奈酚則可能是通過抗氧化以及細(xì)胞毒發(fā)揮抗癌作用[6]。綜上，三種活性成分都有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用，為今后平消膠囊聯(lián)合靶向治療增效減毒、改善耐藥等方面提供新的思路。

PPI結(jié)果顯示，APP與ESR1是平消膠囊治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵蛋白。陳霄等[7]研究表明，APP在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并與結(jié)腸癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示APP可能是結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。GIROUX等[8]研究表明，對(duì)于自發(fā)性結(jié)腸腺瘤，清除ESR能夠使腺瘤體積顯著增加。在相同模型中，ESR再表達(dá)能顯著下調(diào)有致瘤作用的miR-17-92及miR-200a/b的出現(xiàn)[9]，再次印證了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果。分子對(duì)接結(jié)果表明，平消膠囊的主要化學(xué)成分槲皮素、木犀草素、山奈酚對(duì)于兩個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)——APP和ESR1均有一定的結(jié)合能力，也為這三個(gè)活性成分能夠治療結(jié)腸癌提供了依據(jù)。GO和KEGG富集分析表明，平消膠囊抗結(jié)腸癌的機(jī)制主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，其還能夠調(diào)控乙酰膽堿活性，可以緩解癌痛癥狀；其涉及的信號(hào)通路以腫瘤信號(hào)通路為主，這也提示了平消膠囊不僅針對(duì)結(jié)腸癌，對(duì)于乳腺癌、甲狀腺癌等也有一定作用。

由于硝石、礬石為礦物類藥物，干漆為樹脂類藥物，均沒有納入網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的范圍。硝石中Cu、Ba、Na、Se、Ca是抗腫瘤作用的主要無機(jī)成分。Cr、Ca、Al、K是礬石能夠抑制宮頸癌細(xì)胞生長的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，作者推測(cè)這四種元素也是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的物質(zhì)基礎(chǔ)。KIM等[10]的研究表明，干漆中紫鉚花素、非瑟酮以及硫磺菊素等6個(gè)活性成分具有抗增殖作用，這些可能是干漆抗結(jié)腸癌的活性成分。

綜上所述，平消膠囊治療結(jié)腸癌的有效成分可能是槲皮素、木犀草素、山奈酚等，這些成分可能是通過作用于APP以及ESR1蛋白調(diào)節(jié)腫瘤通路從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。其中，槲皮素與靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用可避免靶向藥物耐藥性，今后可能針對(duì)具體的靶向藥物深入開展機(jī)制研究，并有望成為中藥有效成分單體用于結(jié)腸癌治療的新研究方向。根據(jù)臨床療效并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)闡明藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系的方法，可以為中醫(yī)藥精準(zhǔn)治療結(jié)腸癌提供更好的理論依據(jù)和具體方向。