趙赟鑫，謝海彬，葉彥慧，馬 昕，吳永波，解修超，鄧百萬

(1．漢中市科技資源統(tǒng)籌中心，陜西 漢中 723000；2．漢中市漢臺(tái)區(qū)漢麓生物科技有限公司，陜西 漢中 723000；3．陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basiaiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、白磨科(Tricholomataceae)、蜜環(huán)菌屬(Armillaria)[1,2]，是名貴中藥材豬苓和天麻的共生菌，天麻和豬苓的生長(zhǎng)必須依靠蜜環(huán)菌為其提供營(yíng)養(yǎng)[3,4]，1990年徐錦堂等研究發(fā)現(xiàn)天麻在生長(zhǎng)過程中，種子的萌發(fā)必須依靠共生菌紫萁小菇的侵染才能萌發(fā)[5]，蜜環(huán)菌對(duì)種子的萌發(fā)有抑制作用，天麻種子萌發(fā)后蜜環(huán)菌取代紫萁小菇為天麻提供營(yíng)養(yǎng)[6]。秦巴山區(qū)地理位置優(yōu)越，蜜環(huán)菌種質(zhì)資源和林木資源豐富，由于蜜環(huán)菌新品種選育過程復(fù)雜，周期較長(zhǎng)等因素，導(dǎo)致生產(chǎn)中可以使用的蜜環(huán)菌品種較少。為選育蜜環(huán)菌新品種，保障天麻、豬苓栽培穩(wěn)步發(fā)展，課題組通過研究不同蜜環(huán)菌菌株伴栽天麻的品種比較，選育出了“陜蜜2009”新品種，該品種適具有適應(yīng)性強(qiáng)、伴生栽培天麻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性，已通過了陜西省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)辦公室非主要農(nóng)作物品種鑒定登記。

1 材料與方法

1.1 材料

從不同生態(tài)環(huán)境條件的天麻種植區(qū)采集蜜環(huán)菌資源進(jìn)行分離純化，獲得資源菌株18個(gè)，以當(dāng)?shù)厥褂枚嗄甑木?234為對(duì)照(CK)，菌株具體來源見表1。

表1 菌株編號(hào)及來源

萌發(fā)菌為石斛小菇，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供；天麻蒴果及種麻選自烏桿天麻和紅桿天麻，由漢中植物研究所提供。

樹棒采用青岡木，長(zhǎng)度50 cm、直徑6～10 cm，在樹棒2～3面砍成魚鱗口，每窩10～12根樹棒；樹枝長(zhǎng)度3～5 cm，直徑1～2 cm，每窩2.5 kg；樹葉每窩0.5 kg；樹棒和樹葉在有性播種前用清水浸泡24 h，樹枝用0.25% NH4NO3溶液浸泡30 min；無性栽培需提前培養(yǎng)好優(yōu)質(zhì)菌材，即采用長(zhǎng)有蜜環(huán)菌的菌棒和菌枝。

1.2 方法

1.2.1 遺傳特異性分析

1.2.1.1 DNA分子指紋 制備液體種，用CTAB法提DNA[7]；取40 mL TBE緩沖液、0.4 g瓊脂糖，制備1%瓊脂糖凝膠，加3 μL核酸染料，待其凝固；取5 μL 6×Loading Buffer 與5 μL DNA混勻；在1%瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣，常溫下電泳，電壓110 V，時(shí)間30 min，進(jìn)行DNA的檢測(cè)；利用ITS序列對(duì)真菌鑒定[8]，進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增；制備1%瓊脂糖凝膠，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣，電泳時(shí)間1 h，在紫外成像儀上檢測(cè)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司做雙向測(cè)序。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)電泳 制備蜜環(huán)菌酶液和聚丙烯酰胺凝膠；采用Tris-Glycine系統(tǒng)電極緩沖液，pH 8.3，5.0%濃縮膠和10.0%分離膠，上樣量20 μL，溴酚藍(lán)指示劑1滴，上層加10%蔗糖5 μL，4℃下進(jìn)行電泳；電泳初期電壓80 V，樣品進(jìn)入分離膠后保持電壓120 V，時(shí)間4 h；酶染色液使用堅(jiān)牢藍(lán)染色系統(tǒng)，電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移至染色液中，在恒溫振蕩器中37℃低轉(zhuǎn)速下染色，等看到褐色的酯酶同工酶區(qū)帶時(shí)，用水漂洗，保存，照相。

1.2.2 品種比較試驗(yàn)

1.2.2.1 有性栽培 采用室內(nèi)箱栽法進(jìn)行，料土按河沙與雜木屑的體積比1:1拌料均勻，選用65×40×45 cm塑料培養(yǎng)箱，底部鋪有排水孔的塑料薄膜，填進(jìn)料土10 cm，擺放一層濕樹葉0.5 cm作為底葉，將拌過天麻種子的萌發(fā)菌葉均勻地撒在底葉上，取樹棒緊壓在播種層上，棒間距3～5 cm，將蜜環(huán)菌條夾放在兩棒之間，菌枝空隙處放樹枝數(shù)節(jié)，用料土覆蓋3 cm，再按以上操作播第二層，播后蓋料土10 cm，用濕樹葉覆蓋，將四周塑料薄膜拉起蓋在箱面上。每箱用天麻蒴果10個(gè)，萌發(fā)菌1袋，蜜環(huán)菌2.5瓶，樹棒10～12根，每個(gè)處理重復(fù)3次。室內(nèi)管理過程中，溫度控制在25℃以下，夏季最高不超過28℃；濕度控制在60%，冬季濕度在30%即可，管理期間不需要施肥和松土。生長(zhǎng)期為8個(gè)月，產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)以白麻和米麻的總重量來表示。

1.2.2.2 無性栽培 采用室內(nèi)箱栽法，與有性栽培的區(qū)別在于沒有播種層，取提前培養(yǎng)好的菌棒緊壓在底葉上，棒間距6～8 cm，填半溝料土壓實(shí)，將種麻緊靠在菌棒兩頭及兩側(cè)，每根菌棒放種麻8～10個(gè)，如有小米麻可撒在中間，在棒間空隙處斜放樹枝數(shù)節(jié)，如菌棒發(fā)菌不旺，還可夾放蜜環(huán)菌菌枝，料土覆蓋，棒面保持5～10 cm厚度，按上法再栽一層，栽完蓋料土厚15～20 cm，用濕樹葉覆蓋，將四周塑料薄膜拉起蓋在箱面上。按常規(guī)方法管理，8個(gè)月后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量，以白麻和米麻的總重量表示。

1.2.3 區(qū)域試驗(yàn) 2011-2012年度和2012-2013年度連續(xù)兩個(gè)栽培季節(jié)在寧強(qiáng)縣燕子砭鎮(zhèn)、略陽縣五龍洞鎮(zhèn)、勉縣張家河鎮(zhèn)安排不同蜜環(huán)菌品種伴栽天麻試驗(yàn)，供試蜜環(huán)菌菌株為：ZY-17、ZY-5、ZY-9和ZY-7(CK)。栽培天麻品種為秦巴山區(qū)主產(chǎn)的紅桿天麻，種麻為漢中植物研究所統(tǒng)一提供的零代種麻。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置隨機(jī)3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)栽植天麻20窩，各試驗(yàn)點(diǎn)栽培管理措施一致，翌年冬季收獲時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)各小區(qū)天麻產(chǎn)量，分析不同蜜環(huán)菌菌株對(duì)天麻栽培產(chǎn)量的影響。

1.2.4 生產(chǎn)試驗(yàn) 2013年～2015年在秦巴山區(qū)天麻主產(chǎn)區(qū)寧強(qiáng)、勉縣、略陽、留壩、城固、南鄭等地開展ZY-17伴栽天麻生產(chǎn)試驗(yàn)，以當(dāng)?shù)刂髟云贩N“京234”為對(duì)照，對(duì)ZY-17伴栽紅桿天麻、烏桿天麻的有性繁殖和無性繁殖進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)和示范，檢驗(yàn)新選育品種的豐產(chǎn)性、適應(yīng)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳特異性分析

2.1.1 DNA及PCR電泳結(jié)果 圖1結(jié)果顯示，18株蜜環(huán)菌的PCR序列擴(kuò)增片段大小都在500-750 bp范圍。

注：M：DNA marker；1-18：ZY-1、 ZY-2、 ZY-3、 ZY-4、ZY-5、ZY-6 、ZY-7、

2.1.2 rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果及兩兩比較 用Editseq軟件對(duì)堿基長(zhǎng)度、GC含量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如表2。rDNA-ITS堿基片段長(zhǎng)度和DNA序列中GC含量能夠反映出種屬間親緣關(guān)系的遺傳特性[9,10]。

表2 rDNA-ITS的測(cè)序結(jié)果

結(jié)果顯示，18株蜜環(huán)菌的rDNA-ITS堿基片段長(zhǎng)度都在820-860 bp之間(其中含ITS引物，長(zhǎng)度為223-224 bp)，C平均含量為20.8%，G平均含量為23.3%，A平均含量為23.2%，T平均含量為32.8%，GC平均含量為44.1%。除ZY-17與ZY-7外，其他菌株之間rDNA-ITS堿基片段長(zhǎng)度或GC含量不同，這說明除ZY-17與ZY-7外的其他菌株之間遺傳物質(zhì)具有差異性。

利用Megalign軟件對(duì)18株蜜環(huán)菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果如圖2。ZY-17與ZY-7差異度為1.9%，與其他菌株之間差異度在1.4%～8.0%之間，這說明ZY-17與其他菌株在種屬關(guān)系上具有差異性。

圖2 18株蜜環(huán)菌的rDNA-ITS序列相似性(上三角)和差異度(下三角)

2.1.3 酯酶同工酶酶譜分析 對(duì)供試的18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶進(jìn)行電泳，獲到酯酶同工酶酶譜圖，如圖3。

圖3 18株蜜環(huán)菌的酯酶同工酶掃描

如圖3所示，供試18株蜜環(huán)菌酯酶都表現(xiàn)出較強(qiáng)的酯酶活性，18株蜜環(huán)菌共檢測(cè)到112條酯酶同工酶譜帶，每個(gè)菌株均有2-10條不等的酶帶。供試的18個(gè)蜜環(huán)菌菌株得到了16個(gè)酶譜類型，其中ZY-17和ZY-7、ZY-16帶型相似。

依據(jù)酶譜圖中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖，如圖4。結(jié)果顯示，ZY-8和ZY-12無一級(jí)帶，ZY-5、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18各有1條一級(jí)帶，ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-10各有2條一級(jí)帶，ZY-13和ZY-15各有3條一級(jí)酶帶，ZY-9有4條一級(jí)酶帶，ZY-11的一級(jí)酶帶有5條，ZY-6的一級(jí)酶帶有6條，ZY-8、ZY-12、ZY-17、ZY-18無二級(jí)酶帶，ZY-4有6條二級(jí)酶帶，其余菌株均有1-2條二級(jí)酶帶。18個(gè)蜜環(huán)菌菌株的酯酶同工酶譜帶均有不同，說明18個(gè)蜜環(huán)菌菌株之間的遺傳物質(zhì)表現(xiàn)型不同。

圖4 18種蜜環(huán)菌的酯酶同工酶模式

2.2 品種比較試驗(yàn)

2.2.1 有性栽培 經(jīng)過8個(gè)月的有性繁殖，以每箱白麻和米麻的總重量來統(tǒng)計(jì)天麻產(chǎn)量，如表3，在天麻有性繁殖階段，與烏桿天麻種子伴栽的蜜環(huán)菌中天麻產(chǎn)量最高的是ZY-17，為每箱1.004 kg，ZY-9、ZY-5、ZY-16次之，分別為每箱0.893 kg、0.776 kg和0.623 kg，其他菌株的產(chǎn)量均不高；與紅桿天麻種子伴栽的蜜環(huán)菌中，產(chǎn)量最高的菌株是ZY-9，天麻總產(chǎn)量為每箱1.277 kg，其次為ZY-17和ZY-5，分別為每箱1.238 kg和1.109 kg，其余菌株均未超過1 kg。

表3 不同蜜環(huán)菌對(duì)天麻有性栽培產(chǎn)量的影響 (kg)

2.2.2 無性栽培 經(jīng)過8個(gè)月的無性繁殖，以每箱白麻和米麻的總重量來統(tǒng)計(jì)天麻產(chǎn)量，如表4，18株蜜環(huán)菌分別與烏桿天麻的種麻伴栽過程中，ZY-17對(duì)烏天麻產(chǎn)量的影響明顯優(yōu)于其他菌株，為每箱1.523 kg，其次為ZY-9、ZY-5、ZY-3、YZ-18、ZY-15、ZY-8、ZY-16，其余菌株均未超過每箱1 kg；ZY-17對(duì)紅桿天麻產(chǎn)量的影響也明顯優(yōu)于其他菌株，每箱為2.931 kg，ZY-9的產(chǎn)量次之，每箱為2.232 kg，其他菌株的產(chǎn)量均未超過過每箱2 kg。

表4 不同蜜環(huán)菌對(duì)天麻無性栽培產(chǎn)量的影響 (kg)

2.3 區(qū)域試驗(yàn)

通過品種比較試驗(yàn)，優(yōu)選出ZY-17、ZY-5、ZY-9三個(gè)蜜環(huán)菌菌株，以當(dāng)?shù)刂髟云贩N京234為對(duì)照，連續(xù)兩年6點(diǎn)次的區(qū)域試驗(yàn)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。從兩年6點(diǎn)次的區(qū)域試驗(yàn)中可見，ZY-17伴栽天麻產(chǎn)量在各點(diǎn)次均居4個(gè)蜜環(huán)菌品種首位，均較對(duì)照品種京-234增產(chǎn)，增產(chǎn)幅度在29.70%～37.38%之間，比對(duì)照品種京-234平均增產(chǎn)33.17%。

表5 區(qū)域試驗(yàn)產(chǎn)量

2.4 生產(chǎn)試驗(yàn)

2.4.1 有性繁殖 天麻有性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)產(chǎn)量見表6，可見ZY-17伴栽天麻6點(diǎn)次的有性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)中，比對(duì)照品種“京-234”平均增產(chǎn)28.71%，其中4點(diǎn)次伴栽天麻品種為紅桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產(chǎn)28.81%，2點(diǎn)次伴栽天麻品種為烏桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產(chǎn)28.53%。

表6 天麻有性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

2.4.2 無性繁殖 天麻無性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)產(chǎn)量見表7，可見ZY-17伴栽天麻7點(diǎn)次的無性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)中，比對(duì)照品種“京-234”增產(chǎn)28.22%，其中4點(diǎn)次伴栽天麻品種為紅桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產(chǎn)27.22%，3點(diǎn)次伴栽天麻品種為烏桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產(chǎn)29.55%。

表7 天麻無性繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

通過系統(tǒng)選育篩選出具有目標(biāo)性狀的菌株ZY-17，定名“陜蜜2009”。該品種在秦巴山區(qū)多年多點(diǎn)的區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)中，表現(xiàn)出伴栽天麻產(chǎn)量高、菌種適應(yīng)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，符合非主要農(nóng)作物品種鑒定登記的條件，達(dá)到新品種審定要求。該品種于2017年4月25日通過了陜西省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)辦公室非主要農(nóng)作物品種鑒定登記。通過上述生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明，陜密2009新品種可以進(jìn)行推廣伴栽天麻。