高 昆， 冀中英

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 大同 037009;2.山西大同大學(xué) 設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,山西 大同 037009)

銅作為植物體內(nèi)的微量營養(yǎng)元素之一，對(duì)植物進(jìn)行正常的生命活動(dòng)是十分重要的[1]，銅也構(gòu)成了某些金屬蛋白酶，參加植物很多的生物反應(yīng)[2]，但銅過量會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，抑制植物的抗氧化物酶系統(tǒng)和植物的光合作用[3]，從而導(dǎo)致植物的生物量減少、生長發(fā)育遭到妨礙，嚴(yán)重會(huì)引起萎黃病和壞死[4]。除此之外，含量過高的銅還會(huì)對(duì)植物礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和運(yùn)輸造成一定的影響[5]。在韋美玉，熊思，董麗欣等人的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度CuSO4對(duì)芹菜、玉米幼苗、年幼的蘋果樹木的正常生長發(fā)育具有積極的影響，而高濃度CuSO4對(duì)它們會(huì)產(chǎn)生一定的阻礙作用，進(jìn)而導(dǎo)致它們的質(zhì)量和產(chǎn)量下降[6～8]。

在現(xiàn)今的生活中，銅的使用量越來越多，導(dǎo)致了銅污染物排放也越來越多，銅已經(jīng)成為了影響生態(tài)環(huán)境的元素之一[9]。 根據(jù)2014年《全國土壤污染調(diào)查公報(bào)》[10]的報(bào)道顯示，銅是耕地和金屬冶煉工業(yè)園區(qū)及其周邊土壤的主要污染物[11]。一般情況下，土壤中銅的總含量為15～40 mg·kg-1，但當(dāng)土壤中銅的總含量為150～400 mg·kg-1，會(huì)給植物帶來毒害作用[6]。

葛(Puerarialobata)是多年生豆科(Leguminosae)藤本植物，主要分布于熱帶和溫帶，中國擁有豐富的葛屬植物種質(zhì)資源，約有9個(gè)種，2個(gè)變種，其中野葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi)和粉葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi var.thomsonii(Benth.) Vaniot der Maesen)在中國的開發(fā)應(yīng)用最廣，分布也最廣[12]。葛的各部分均具有使用價(jià)值，葛的根、葉、花都可以入藥，葛根還可以被開發(fā)為保健食品；葛藤纖維可用于織物與造紙；葛葉可被用作天然的優(yōu)質(zhì)飼料。除此之外，葛還具有保持和改良水土的生態(tài)作用[12～13]。并且在本次新冠肺炎疫情中，葛根湯顆粒在預(yù)防以及早期治療過程中發(fā)揮了重要作用。

實(shí)驗(yàn)選用的葛品種是粉葛(P.thomsoniiBenth)，它的葉呈綠色，塊根比較粗大、形狀類似長棒形或紡錘形[14]。粉葛適合生長在相對(duì)溫暖、濕潤的氣候，能抵抗一定程度的寒冷和干旱[15]。它的適應(yīng)性也比較廣，病蟲害也相對(duì)較少，在大多數(shù)土壤中均可栽培，但黏土與堿性土除外[15]。粉葛的主要利用部位是根部，即葛根。葛根的地上部分含有葛根素[16], 在臨床上被大量應(yīng)用，可用于治療冠心病、偏頭痛等[17]。研究表明，葛根可以使心率減慢，血壓降低[18]，還可以使腦血管擴(kuò)張，改善大腦供氧[19]。除此之外，葛根也能夠使腦微循環(huán)障礙得到改善，降低血脂，調(diào)節(jié)血糖[20]。

近些年來，葛在發(fā)掘種質(zhì)資源、改善栽培技術(shù)以及臨床應(yīng)用等方面的研究頗多，還未見重金屬脅迫對(duì)葛幼苗生長和生理特性的影響方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究銅脅迫時(shí)對(duì)粉葛生長及其生理指標(biāo)的影響，以期為葛根安全規(guī)范種植和保證藥材的品質(zhì)提供一定的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所選用的粉葛幼苗購買于廣西藤縣綠州農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，所購的幼苗帶有一部分根和葉。

1.2 方法

1.2.1 粉葛幼苗的栽培 挑選粗細(xì)一致且無病蟲害的粉葛幼苗，先用自來水沖洗至潔凈，然后置于裝有常溫自來水的透明玻璃瓶中培養(yǎng)5 d，進(jìn)行緩苗。

1.2.2 粉葛幼苗的銅脅迫 Cu2+以CuSO4·5H2O的形式提供，選取生長勢(shì)基本一致的粉葛幼苗，并將其分成5組，每組3瓶，每瓶2株，5組分別如下：

處理①——對(duì)照(不施CuSO4溶液)；

處理②——施0.01 mg·L-1CuSO4溶液；

處理③——施0.03 mg·L-1CuSO4溶液；

處理④——施0.06 mg·L-1CuSO4溶液；

處理⑤——施0.1 mg·L-1CuSO4溶液；

②～⑤組各添加100 mL上述濃度的CuSO4溶液， ①組添加100 mL的蒸餾水作為對(duì)照。每瓶上做好溶液體積的刻度標(biāo)記，脅迫處理期間，若溶液體積低于刻度線，則需要及時(shí)添加適量的蒸餾水以補(bǔ)充損失的水分，保持銅離子濃度恒定。在銅脅迫0 d，3 d，6 d，9 d，12 d時(shí)，對(duì)5組分別取樣測(cè)定。

1.2.3 形態(tài)觀察 觀察并記錄各組粉葛幼苗銅脅迫處理12 d后葉片的形態(tài)特征，并將銅脅迫對(duì)粉葛幼苗的影響程度分為5個(gè)級(jí)別：

1級(jí)——葉尖、葉緣焦枯并有小部分葉脫落；

2級(jí)——葉尖、葉緣變黃；

3級(jí)——生長正常(無葉尖、葉緣變黃和葉片脫落現(xiàn)象)；

4級(jí)——小部分葉片舒展、葉色濃綠；

5級(jí)——大部分葉片舒展、葉色濃綠。

1.2.4 測(cè)定生長指標(biāo) 葉長、葉寬的增長率：各組隨機(jī)選取3株幼苗，在銅脅迫0 d，3 d，12 d時(shí)，用直尺測(cè)定同一葉位同一葉片的葉長、葉寬(精確到0.1 cm)，并計(jì)算增長率(A)，計(jì)算方法按潘雪峰[21]的方法測(cè)定，方法如下：

式中，A——葉長(或葉寬)的增長率，C——銅脅迫0d時(shí)的葉長(或葉寬)，D——銅脅迫3 d，12 d的葉長(或葉寬)。

1.2.5 測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo) 各組隨機(jī)摘取粉葛幼苗長勢(shì)相近的葉片，然后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。處理①～⑤各重復(fù)3次，各指標(biāo)及其測(cè)定的方法如下：

(1)在銅脅迫3 d，6 d，9 d，12 d后用SPAD-502PLUS葉綠素計(jì)測(cè)定葉片銅脅迫下的SPAD值；

(2)在銅脅迫12 d后按照考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[22]；

(3)在銅脅迫12 d后采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量和可溶性糖含量[23]；

(4)在銅脅迫12 d后采用電導(dǎo)儀法[24]測(cè)定膜的相對(duì)透性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，用Excel 2010進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對(duì)粉葛幼苗外觀形態(tài)的影響

由表1可知，銅離子濃度不同，對(duì)粉葛幼苗生長形態(tài)的影響有所不同，其中0.01 mg·L-1和0.03 mg·L-1濃度下，粉葛幼苗葉片的外觀形態(tài)良好，而0.06 mg·L-1和0.1 mg·L-1濃度下，粉葛幼苗葉片的外觀形態(tài)與對(duì)照組相比較差。

表1 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗葉片的影響程度及葉片癥狀

2.2 銅脅迫對(duì)粉葛幼苗生長指標(biāo)的影響

由圖1可知，粉葛幼苗葉片的葉長增長率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，并且在高濃度銅離子處理的條件下，時(shí)間越長，濃度越大，葉長增長率下降越明顯，處理②～⑤組與對(duì)照組均形成極顯著差異(P<0.01)。在處理3 d時(shí)，處理③的粉葛幼苗葉片的葉長增長率達(dá)到最大值，為8.33 %，而處理⑤的葉長增長率降至最低，為6.80 %。在處理12 d時(shí)，粉葛幼苗葉片的葉長增長率在處理③和處理⑤條件下，分別達(dá)到最大和最小值，分別為8.54 %、6.67 %。當(dāng)施用的銅離子濃度低于0.03 mg·L-1時(shí)，處理12 d的葉長增長率均高于3 d，而當(dāng)施用的銅離子濃度高于0.03 mg·L-1時(shí)，處理12 d的葉長增長率均低于3 d。根據(jù)表2可知，處理天數(shù)和處理濃度之間存在互作，濃度的作用效果十分顯著，而天數(shù)的作用并不明顯。處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件對(duì)粉葛幼苗的促進(jìn)效果最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，對(duì)粉葛幼苗的抑制作用最顯著。這說明，低濃度銅離子會(huì)促進(jìn)粉葛幼苗的生長，而高濃度銅離子則會(huì)抑制其生長。

圖1 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗葉長增長率的影響

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn) 因變量：葉長

由圖2可知，粉葛幼苗葉片的葉寬增長率呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且在高濃度銅離子處理的條件下，時(shí)間越長，濃度越大，葉寬增長率下降并不明顯，各組與對(duì)照組均形成極顯著差異(P<0.01)。在處理3 d時(shí)，處理③的粉葛幼苗葉片的葉寬增長率達(dá)到最大值，為8.76 %，而處理⑤的葉寬增長率降至最低，為7.66 %。在處理12 d時(shí)，粉葛幼苗葉片的葉寬增長率在處理③和處理⑤條件下，分別達(dá)到最大和最小值，分別為8.83 %、7.64 %。在銅離子濃度低于0.03 mg·L-1時(shí)，處理12 d的葉寬增長率均高于3 d，而當(dāng)銅離子濃度高于0.03 mg·L-1時(shí)，處理12 d的葉寬增長率與處理3 d相差不大，并無顯著差異。根據(jù)表3可知，濃度和天數(shù)之間存在互作，濃度和天數(shù)的作用效果均比較顯著。處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件對(duì)粉葛幼苗的促進(jìn)效果最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，對(duì)粉葛幼苗的抑制作用最顯著。這說明銅脅迫對(duì)粉葛幼苗的生長具有低促高抑的作用。

圖2 同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗葉寬增長率的影響

表3 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn) 因變量：葉寬

2.3 銅脅迫對(duì)粉葛幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 對(duì)粉葛幼苗SPAD值的影響 SPAD值能夠用來反映粉葛幼苗葉片的葉綠素含量。由圖3可知，在施用低濃度銅離子的條件下，SPAD值隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢(shì)，而在高濃度銅離子處理?xiàng)l件下，SPAD值則隨著時(shí)間的增加表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，并且時(shí)間越長，濃度越大，下降程度越明顯。在處理②和處理③中，時(shí)間越長，SPAD值越大，且均與對(duì)照組(處理①)形成極顯著差異(P<0.01)，處理③比處理②增加的程度更大。在處理②中，SPAD值升至最高為46.87，在處理③中，SPAD值升至最高為48.63。在處理④和處理⑤中，隨著時(shí)間的增加，SPAD值表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，并且兩個(gè)處理組均與對(duì)照呈極顯著差異(P<0.01)。在處理④中，SPAD值降至36.53，達(dá)到最小值，處理⑤中的SPAD值均低于處理④，并且最小值為33.60。根據(jù)表4可知，處理濃度和處理天數(shù)之間存在互作，并且濃度和天數(shù)的作用效果均十分顯著。在處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件下，粉葛幼苗的SPAD值增幅最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，粉葛幼苗的SPAD值的降低最顯著。這說明，粉葛幼苗能抵抗一定濃度的銅脅迫，但超過一定限度后，SPAD值會(huì)出現(xiàn)下降，即葉綠素含量下降。

圖3 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗SPAD值的影響

表4 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn) 因變量：SPAD

2.3.2 對(duì)粉葛幼苗可溶性蛋白含量的影響 由圖4可知，粉葛幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)的含量會(huì)隨著Cu2+濃度的增加而表現(xiàn)出先增加后下落的趨勢(shì)，并且與對(duì)照組形成極顯著差異(P<0.01)，處理②與處理③的增幅并沒有明顯差異。處理②～處理⑤可溶性蛋白的含量分別為16.43 mg·g-1、17.13 mg·g-1、13.90 mg·g-1、13.16 mg·g-1，并且在0.03 mg·L-1銅離子處理?xiàng)l件下，粉葛幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大，與對(duì)照相比升高了13.57 %，而在0.1 mg·L-1銅離子處理?xiàng)l件下，可溶性蛋白質(zhì)含量降至最小值，比對(duì)照組降低了12.73 %。這說明，低濃度Cu2+可以提高粉葛幼苗中可溶性蛋白質(zhì)的含量，而高濃度Cu2+會(huì)使粉葛幼苗中的可溶性蛋白質(zhì)的含量出現(xiàn)下降的情況。

圖4 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.3.3 粉葛幼苗丙二醛(MDA)、膜相對(duì)透性的變化 由圖5可知，粉葛幼苗葉片中的MDA會(huì)隨著Cu2+濃度的升高而表現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中處理②、處理③與對(duì)照組之間沒有形成顯著差異(P>0.05)，處理④和處理⑤與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，處理④與處理⑤之間沒有很明顯的差別。在外施的銅離子濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，粉葛幼苗葉片的MDA含量升到最高，并且比對(duì)照組提高了31.18 %。這說明，外施銅離子會(huì)使粉葛幼苗葉片的MDA含量提高，并且銅離子濃度越大，MDA含量的提高，從一定程度上反映了細(xì)胞膜的受害程度。

圖5 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗丙二醛含量的影響

膜的透性可以用電導(dǎo)率來反映[33]。圖6反映出，粉葛幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，其中處理②與對(duì)照組(處理①)之間沒有形成顯著差異(P>0.05)，處理③～④組均與對(duì)照呈極顯著差異(P<0.01)，各組之間均有明顯的差別。在處理⑤時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率上升到最大，為29.61 %，比對(duì)照組提高了181.73 %。這說明，高濃度銅離子會(huì)損傷粉葛幼苗的細(xì)胞膜。

圖6 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.3.4 對(duì)粉葛幼苗糖含量的影響 從圖7可以得到，隨著銅離子濃度增大，粉葛幼苗葉片中的可溶性糖含量逐漸攀升，銅離子濃度達(dá)到0.1 mg·L-1時(shí)，增幅最明顯，處理②、處理③與對(duì)照組形成的差異并沒有那么顯著(P>0.05)，處理④與對(duì)照組形成了較為顯著的差異(P<0.05)，處理⑤則與對(duì)照組形成了極顯著差異(P<0.01)。處理②～處理⑤可溶性糖的含量分別為0.38 μmol·g-1·FW、0.40 μmol·g-1·FW、0.44 μmol·g-1·FW、0.60 μmol·g-1·FW，相對(duì)于對(duì)照組(處理①)分別增加了5.04 %、12.89 %、22.97 %、68.52 %。這說明銅離子濃度高低會(huì)影響粉葛幼苗中可溶性糖的含量。

圖7 不同濃度銅離子對(duì)粉葛幼苗可溶性糖含量的影響

3 結(jié)論與討論

重金屬的毒害作用會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的生命活動(dòng)發(fā)生混亂，從而阻礙植物的生長，嚴(yán)重會(huì)引起死亡。然而，大部分植物都會(huì)對(duì)重金屬的毒害作用表現(xiàn)出應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)，如植物具備的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)機(jī)制[26]，提供重金屬離子的附著位點(diǎn)[4]，液泡隔離、吸收重金屬離子[4]等。銅離子在不同植物中的含量不同，粉葛中銅含量為0.03 mg·L-1[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，粉葛幼苗在低濃度銅離子條件下(0.01 mg·L-1和0.03 mg·L-1)，葉片長勢(shì)好，葉色濃綠，然而，隨著銅離子濃度的增加葉尖、葉緣逐漸變黃、焦枯，甚至有一小部分脫落死亡。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子濃度的逐漸上升，粉葛幼苗葉片的葉長和葉寬增長率均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，這與潘雪峰[21]、趙艷[28]、周娜娜[29]等人的研究結(jié)果一致，并且在銅離子濃度達(dá)到0.03 mg·L-1時(shí)，葉長和葉寬的增長率均達(dá)到最大值。這可能是由于在低濃度銅離子處理?xiàng)l件下，激活了粉葛幼苗的抗逆性反應(yīng)，從而促進(jìn)了其葉片的生長，而高濃度的銅離子會(huì)使植物體內(nèi)的代謝紊亂，從而阻礙了葉片的生長。

根據(jù)喬潤雨[30]、宋慧[31]等人的報(bào)道顯示，用SPAD值來反映不同蔬菜和甜瓜幼苗不同位置葉片的葉綠素含量是可靠的，兩者之間表現(xiàn)有正相關(guān)性[32]，并且方法操作簡(jiǎn)單。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度銅離子處理?xiàng)l件下，SPAD值隨著時(shí)間的延長而逐漸上升，但是，在施用高濃度銅離子的情況下，SPAD值則會(huì)隨著時(shí)間的增加而逐漸下降，并且時(shí)間越長，濃度越大，下降越明顯。這說明，低濃度銅離子會(huì)促進(jìn)葉綠素含量的增加，而高濃度銅離子則會(huì)降低葉綠素含量。這可能是由于銅是電子傳遞鏈中的質(zhì)體藍(lán)素的組成成分[33]，并且少量的銅離子有助于葉綠素的合成。但是，銅離子不是越多越好，銅離子濃度過高一方面會(huì)引起銅離子替代葉綠素中的鎂離子，從而阻礙了葉綠素的合成，另一方面也會(huì)破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，影響類囊體膜的組成和光系統(tǒng)之間的協(xié)調(diào)功能，最終妨礙了光合作用的進(jìn)行[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)，粉葛幼苗葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量在低濃度銅離子條件下有所增加，而在高濃度銅離子處理?xiàng)l件下則顯著下降，這與朱健[34]等人的研究結(jié)果一致。表現(xiàn)出這種趨勢(shì)的原因可能是在粉葛幼苗體內(nèi)產(chǎn)生了一些抵抗逆境脅迫 的蛋白，使得可溶性蛋白質(zhì)含量升高。然而，銅離子的積累會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的正常合成，最終導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的含量出現(xiàn)降低的情況。

膜脂過氧化作用的產(chǎn)物主要是MDA[35]。用電導(dǎo)率來反映質(zhì)膜透性也是可靠的，它們之間表現(xiàn)有一定的正相關(guān)。因此，以上兩種方法均可以用來衡量粉葛幼苗細(xì)胞膜受銅脅迫傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是丙二醛含量還是相對(duì)電導(dǎo)率都在逐漸上升，與趙淑玲[33]、馬曉華[26]等人的研究結(jié)果一致。這可能是由于銅脅迫造成粉葛幼苗細(xì)胞膜受到破壞，從而造成丙二醛含量增加，與此同時(shí)，膜的透性程度增加，引起一些電解質(zhì)向胞外滲出，相對(duì)電導(dǎo)率也相應(yīng)增大。

可溶性糖是植物在逆境條件下為保護(hù)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[35]。本次的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖的含量會(huì)隨著銅離子濃度的不斷增大而逐漸升高，這可能是由于粉葛幼苗為提升細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力而采取的一種手段。綜上，銅脅迫會(huì)影響粉葛幼苗的生長及生理指標(biāo)，銅離子濃度低時(shí)，會(huì)促進(jìn)粉葛幼苗的生長及生理響應(yīng)，而高濃度的銅離子會(huì)使葉綠素和可溶性蛋白的含量出現(xiàn)降低的情況，電解質(zhì)也易向胞外滲出，同時(shí)產(chǎn)生了MDA和可溶性糖，從而阻礙了粉葛幼苗的正常生長發(fā)育。