孟憲雙， 白樺， 馬強(qiáng)， 張鵬， 馬宏， 鄧玉林

(1. 北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

執(zhí)行空間飛行任務(wù)的宇航員面臨空間輻射帶來(lái)的潛在危害[1-3]，尤其當(dāng)宇航員執(zhí)行出艙作業(yè)時(shí)，其頭面部防護(hù)的相對(duì)薄弱增加了受到空間輻射的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]，輻射對(duì)發(fā)育早期神經(jīng)細(xì)胞分裂行為的干擾，將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能的異常[6-8]；此外，放射治療是頭頸部原發(fā)及轉(zhuǎn)移腫瘤的重要治療方法，然而在接受放射治療后，往往會(huì)導(dǎo)致患者嚴(yán)重的并發(fā)癥-放射性腦損傷[9]. 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤發(fā)病率和確診率逐年增加，同時(shí)隨著各種放療技術(shù)的臨床應(yīng)用以及先進(jìn)影像等技術(shù)的使用，頭頸部病灶的發(fā)現(xiàn)率也在增大，因此，近幾年放射性腦損傷的確診率在總體呈上升趨勢(shì). 根據(jù)時(shí)程和臨床表現(xiàn)，輻射誘導(dǎo)的腦損傷分為急性、早期遲發(fā)和晚期遲發(fā)性損傷[10]，急性癥狀一般是短暫且可逆的，而晚期遲發(fā)性癥狀是進(jìn)行性且不可逆轉(zhuǎn)的，因此，評(píng)估生物機(jī)體輻照后早期的特異反應(yīng)，系統(tǒng)研究機(jī)體內(nèi)早期出現(xiàn)的代謝物變化情況，對(duì)于降低輻射暴露后早期可能造成的傷害和改善治療策略是非常有必要的，同時(shí)也可為進(jìn)一步理解和闡述輻射損傷的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

本實(shí)驗(yàn)室在全腦輻照誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷變化規(guī)律及由神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的外周免疫系統(tǒng)間接效應(yīng)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究并形成了一系列研究成果[11-13]. 前期研究成功建立了大鼠全腦輻照誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型，并采用影像學(xué)手段和蛋白表達(dá)水平分析等技術(shù)對(duì)動(dòng)物模型機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)，如各種細(xì)胞因子，進(jìn)行了表達(dá)分析，闡述了不同腦區(qū)的敏感性差異及其機(jī)理. 本文重點(diǎn)探究全腦輻照誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷發(fā)生后，外周血中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量的變化情況，以期尋找潛在的生物標(biāo)志物. 針對(duì)外周血中42種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，作者基于超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿復(fù)合線性離子阱技術(shù)建立了靶向測(cè)定方法[14]. 鑒于多數(shù)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在反相色譜中保留效果差、質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度低的特點(diǎn)，采用苯甲酰氯進(jìn)行衍生化，經(jīng)衍生化后的待測(cè)物色譜保留好，靈敏度高. 由于待測(cè)物均為血清內(nèi)源性小分子化合物，實(shí)驗(yàn)采用磷酸緩沖鹽溶液+牛血清白蛋白作為空白血清模擬液進(jìn)行質(zhì)量控制樣本和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制，然后按照確定的方法處理，經(jīng)衍生化后的物質(zhì)采用內(nèi)標(biāo)法定量，未衍生化的乙酰膽堿和褪黑素采用外標(biāo)法定量，檢出限和定量下限分別為0.05～11.63 nM和0.09～46.50 nM，靈敏度高，能夠滿足血清中42種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析要求；采用蛋白沉淀法，樣本與蛋白沉淀劑體積比例為1∶4，針對(duì)6種不同種類的溶劑/溶液進(jìn)行了沉淀劑的考察，選擇0.1%甲酸-乙腈體系作為蛋白沉淀劑. 方法特異性好，靈敏度高，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在各自線性范圍內(nèi)線性良好(線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99)，儀器精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)確度、日內(nèi)及日間精密度、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)及殘留效應(yīng)均滿足生物樣本的分析需求.

本研究利用上述已建立的靶向分析方法，采用靶向代謝組學(xué)策略，通過(guò)單維和多維統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究全腦輻照暴露下神經(jīng)損傷大鼠的血清樣本與健康血清樣本間的代謝輪廓差異，尋找顯著性差異代謝物，發(fā)現(xiàn)全腦輻照暴露下神經(jīng)損傷的潛在生物標(biāo)志物，并映射機(jī)體內(nèi)相關(guān)的代謝通路，探索全腦輻照誘導(dǎo)神經(jīng)損傷可能的發(fā)生機(jī)制，為早期診斷和改善治療策略提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器、材料與試劑

超高效液相色譜儀(UHPLC，美國(guó)SCIEX公司，ExionLC型，配二元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱)；串聯(lián)四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(QTrap，美國(guó)SCIEX公司，6500+型)；渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司，MS2型)；超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司；YM-080S型)；超低溫保存箱(中國(guó)海爾公司，DW-86L626型)；超純水儀(美國(guó)Millipore公司，MILLI-Q50型).

42種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，包括α-丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、β-丙氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、甘氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、腐胺、絲氨酸、亞精胺、精胺、蘇氨酸、纈氨酸、3,4-二羥苯乙酸、γ-氨基丁酸、5-羥基吲哚乙酸、乙酰膽堿、精氨酸、多巴胺、谷氨酰胺、組胺、組氨酸、高香草酸、犬尿氨酸、去甲腎上腺素、5-羥色胺、色胺、色氨酸、酪胺、酪氨酸、左旋多巴胺、5-羥基色氨酸、谷氨酸、腎上腺素、褪黑素、章魚胺、香草扁桃酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司、德國(guó)Dr.Ehrestorfer公司和美國(guó)AccuStandard公司；LC-MS級(jí)甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，5～6周齡，SPF級(jí)，γ射線輻照前200～250 g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002. 全部動(dòng)物程序均經(jīng)北京理工大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行飼養(yǎng). 大鼠飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002；飼養(yǎng)條件：北京理工大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，屏障環(huán)境，合格證號(hào)：SYXK(京)2017-0031；大鼠為獨(dú)立隔離飼養(yǎng)籠具飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境控制：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，噪音不超過(guò)60 dm(A)，氨濃度不超過(guò)14 mg/m3，自然光照，每天12 h，輻照前，所有大鼠使用標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水進(jìn)行喂養(yǎng)(自由飲水進(jìn)食).

1.3 γ射線全腦輻照實(shí)驗(yàn)

輻照部位為從眼球后援至枕骨前緣. γ射線輻照前，將大鼠用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉(劑量為0.3 mL/100 g體重). 將大鼠標(biāo)記好號(hào)碼并豎直懸掛進(jìn)行體位固定，使用鉛磚將自頸部下半身屏蔽，室溫條件下對(duì)腦部進(jìn)行輻照.60Co γ射線源距為1 m，一次性輻照，輻照劑量為10、20、30、40和50 Gy，劑量率為2.519 4 Gy/min. 其中，分次累積全腦輻照采用每周進(jìn)行10 Gy劑量輻照，共3次(總劑量為30 Gy)的方式進(jìn)行. 因60Co γ射線在定位照射方面存在一定難度，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鉛磚屏蔽95%以上射線，因此，可用來(lái)模擬腦局部輻照. 輻照后的實(shí)驗(yàn)大鼠被運(yùn)送回至北京理工大學(xué)生命學(xué)院動(dòng)物房，繼續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)維持飼料和純凈水喂養(yǎng)，直至處死.

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

每組大鼠(8只)在輻照30天后，用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉(劑量為0.3 mL/100 g體重)取腦組織，稱取180 mg置于勻漿管，加入4 ℃預(yù)冷0.9%生理鹽水，將腦組織剪碎進(jìn)行勻漿處理(冰上操作)，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，為避免反復(fù)凍融可進(jìn)行分裝，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?，分別進(jìn)行氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量的測(cè)定. 電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷主要通過(guò)間接作用，作用于機(jī)體內(nèi)的大分子，使其發(fā)生電離作用，產(chǎn)生自由基. 自由基作為機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，一方面與超氧化物歧化酶(SOD)作用，導(dǎo)致其酶活性下降，另一方面它還可攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等，使得脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高，造成組織細(xì)胞受損. MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量高低可作為反映機(jī)體氧化損傷的間接指標(biāo)；谷胱甘肽有還原型(GSH)和氧化型(L-Glutathione oxidized,GSSG)兩種形式，在生理?xiàng)l件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù). 當(dāng)輻照誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基時(shí)，GSH因參與自由基的清除和過(guò)氧化物的解毒而被消耗生成GSSG；8-羥基脫氧鳥苷是敏感的DNA損傷標(biāo)志物，其生成原因主要包括電離輻射、化學(xué)致癌物以及細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS攻擊DNA中鳥嘌呤生成8-羥基脫氧鳥苷.

1.5 血清采集

將全部大鼠稱重并以戊巴比妥鈉以腹腔注射(60 mg/kg體重)進(jìn)行麻醉；待麻醉后約20 min，將大鼠以仰臥位固定于木板上，用環(huán)形鉗夾住大鼠頸部及左右腹股溝，環(huán)形鉗手柄套固定于鐵釘，大鼠即固定好；打開(kāi)胸腔，將心臟暴露，進(jìn)行心尖取血. 取完血后將血置于滅菌的離心管中，室溫下凝固1～2 h(如凝血效果不好，可放置4 ℃冰箱過(guò)夜，使血液充分凝固)，待凝固后，4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝并標(biāo)記好，置于-80 ℃黑暗條件下保存，用于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析測(cè)定.

關(guān)于血清樣本處理、空白血清模擬液的配制及色譜-質(zhì)譜方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14].

1.6 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理. 當(dāng)信號(hào)接近背景時(shí)，會(huì)增加分析誤差，基于這些數(shù)據(jù)的結(jié)論是可疑的，在進(jìn)一步分析前消除這些噪聲；對(duì)單個(gè)色譜峰進(jìn)行過(guò)濾篩選，每個(gè)組別中只保留空值不超過(guò)50%或所有組別中空值不多于50%的色譜峰數(shù)據(jù)；對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬(missing value recording)，缺失值模擬方法為最小值1/2進(jìn)行填補(bǔ).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

單變量統(tǒng)計(jì)分析的計(jì)算結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差”表示，并采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Student'st-test)，當(dāng)p<0.05，認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，當(dāng)p<0.01時(shí)，認(rèn)為具有極顯著性差異，不同組別之間神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的濃度比較采用倍數(shù)變化(fold change,FC)值表示. 進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，將處理后的LC-MS/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入至SIMCA-P軟件(Version 15.0.2,Umetrics AB,Umea,Sweden)進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析. 首先采用無(wú)師監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)法建立多維統(tǒng)計(jì)模型，進(jìn)行各組樣本間整體分布情況及有無(wú)離散樣本點(diǎn)的考察，并且通過(guò)質(zhì)控樣本在PCA中的聚集程度考察該分析批次LC-MS系統(tǒng)的穩(wěn)定性；然后采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)法構(gòu)建模型，以區(qū)分不同組別樣本以及其中的差異神經(jīng)化學(xué)物質(zhì).

2 結(jié)果與討論

2.1 輻射劑量的選擇

適宜的輻照劑量是本實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，因此，結(jié)合全腦輻照后氧化應(yīng)激指標(biāo)含量的變化情況及實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ). 本實(shí)驗(yàn)首先確定輻照劑量. 從表1可以看出，與對(duì)照組相比，3個(gè)輻照組大鼠腦組織中的丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷的濃度均出現(xiàn)升高趨勢(shì)，其中除10 Gy組與對(duì)照組之間丙二醛的差異無(wú)顯著性差異外，其他的組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且其中除20 Gy組與對(duì)照組的差異p<0.05外，其他組間差異均具有極顯著性差異(p<0.01). 與對(duì)照組相比，3個(gè)輻照組大鼠腦組織中的還原型谷胱甘肽含量呈下降趨勢(shì)，且10 Gy、20 Gy、30 Gy、40 Gy、50 Gy與對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05和p<0.01). 這主要是因?yàn)殡婋x輻射對(duì)機(jī)體的損傷主要通過(guò)間接作用，作用于機(jī)體內(nèi)的大分子，使其發(fā)生電離作用，產(chǎn)生活性氧自由基(ROS). 當(dāng)體內(nèi)ROS產(chǎn)生量大于機(jī)體可承受的抗氧化能力后，就會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷. 因此，3種與氧化應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)源性抗氧化組分的含量變化可間接反映鼠腦經(jīng)輻照后的受損程度. 本實(shí)驗(yàn)在對(duì)大鼠進(jìn)行三個(gè)不同劑量的γ射線全腦輻照后，綜合大鼠的一般狀態(tài)、生存率和氧化應(yīng)激等指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，旨在達(dá)到輻射具有生物學(xué)效應(yīng)的同時(shí)，又不至造成實(shí)驗(yàn)大鼠基本機(jī)能的喪失或死亡，采用10 Gy作為低劑量進(jìn)行大鼠全腦輻照.

表1 不同輻照劑量下大鼠丙二醛、還原型谷胱甘肽及8-羥基脫氧鳥苷含量的比較Tab.1 Comparison of the concentrations of MDA,GSH,and 8-OHdG of rats irradiated in different

實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，在全腦輻照后30 d，30 Gy的γ射線可導(dǎo)致大鼠探索行為及肢體活動(dòng)能力明顯下降，且焦慮和抑郁水平明顯上升，指示γ射線全腦輻照對(duì)腦功能存在潛在的影響作用；通過(guò)18F-FDG micro PET-CT研究大鼠腦內(nèi)葡萄糖代謝情況，發(fā)現(xiàn)30 Gy的劑量可引起海馬和皮層(包括頂葉相關(guān)皮層、聽(tīng)覺(jué)皮層、感覺(jué)皮層和運(yùn)動(dòng)皮層)中葡萄糖代謝下降. 在輻照后90 d，皮層中葡萄糖代謝已經(jīng)恢復(fù)，但海馬中葡萄糖代謝的下降趨勢(shì)仍較顯著. 這不僅說(shuō)明不同腦區(qū)葡萄糖代謝對(duì)輻照的敏感性存在差異，而且有著時(shí)間上依賴性，表明30 Gy的全腦輻照劑量已造成一定程度的神經(jīng)損傷，而該輻照劑量對(duì)大鼠的存活率又無(wú)顯著影響，因此，本課題擬選擇γ射線的30 Gy作為大鼠全腦輻照模型的最大輻照劑量.

由于在頭頸癌的放療過(guò)程中，通常采用分次累積輻照的方式進(jìn)行，因此本研究擬同樣采用分次輻照的模式進(jìn)行臨床模擬. 由于全腦輻照過(guò)程中需進(jìn)行麻醉，若分次次數(shù)較多，則平均每次輻照劑量較小，意味著麻醉次數(shù)過(guò)多，而麻藥對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生較大的危害作用，因此，為避免反復(fù)麻醉，本實(shí)驗(yàn)選擇單束輻照劑量為10 Gy，共輻照3次. 在輻照中和輻照后，均未發(fā)現(xiàn)大鼠的非正常死亡現(xiàn)象.

2.2 單變量統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的定量結(jié)果(每只大鼠測(cè)定一次，組內(nèi)大鼠的結(jié)果取平均值)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，計(jì)量結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異. 與對(duì)照組相比，輻照組(10 Gy、30 Gy和10 Gy×3)中多數(shù)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的濃度呈下降趨勢(shì)，且有些物質(zhì)的濃度下降趨勢(shì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，如去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸、酪胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸的濃度顯著性下降，而少量神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)濃度呈顯著性上升趨勢(shì)(p<0.05)，如乙酰膽堿和褪黑素，濃度變化倍數(shù)分別為4.68(30 Gy組/對(duì)照組)和10.00(30 Gy組/對(duì)照組). 值得注意的是，分次累積輻照組(10 Gy×3)與30 Gy輻照組相比，由于分次累積輻照造成的機(jī)體損傷小于單次相同劑量的輻照，因此，10 Gy×3輻照組神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)濃度的變化情況(與對(duì)照組相比)沒(méi)有30 Gy輻照組明顯；另外，與對(duì)照組相比時(shí)，有些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的濃度在10 Gy劑量輻照后早期表現(xiàn)為下降，而在30 Gy劑量輻照后(與10 Gy組比較)，濃度卻表現(xiàn)為不同程度的上升. 實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了在10 Gy組與對(duì)照組、30 Gy組與10 Gy組以及10 Gy×3組與30 Gy組對(duì)比分析中，具有顯著性差異(p<0.05)的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，包括去甲腎上腺素、乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、酪胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、褪黑素、α-丙氨酸和甘氨酸. 單變量統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示全腦輻照損傷的機(jī)理比較復(fù)雜，僅用一種代謝物的濃度變化情況很難滿足早期損傷診斷的準(zhǔn)確度要求. 而結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析則能綜合多個(gè)變量的差異性信息，在不同組別間的分類中具有單變量分析不可比擬的優(yōu)勢(shì). 因此，本研究將結(jié)合多變量分析模型進(jìn)行對(duì)照組與輻照組的分類研究.

表2 對(duì)照組和輻照組大鼠血清中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的濃度(nmol/L)變化

續(xù)表

2.3 多變量統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1主成分分析

PCA模型中兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率PC(1)為0.693，PC(2)為0.107，累計(jì)貢獻(xiàn)率為0.8，表明所選主成分可較真實(shí)地反映原變量信息，得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1.圖中無(wú)異常離散樣本點(diǎn)，全部處于95%置信區(qū)間(Hotelling’s T-squared ellipse)內(nèi)，對(duì)照組血清樣本分布比較緊湊，而不同劑量的輻照組分布比較分散；對(duì)照組與10 Gy、30 Gy和10 Gy×3輻照組早期的血清樣本具有一定的分離趨勢(shì)，而不同劑量的輻照組不能很好的區(qū)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCA模型不能完全區(qū)分對(duì)照組和不同劑量的輻照組以及分次累積輻照組早期的血清樣本. 另外，值得注意的是，在PCA分析中，全體質(zhì)控樣本點(diǎn)均較密集地聚集在象限中央位置附近，表明系統(tǒng)和方法具有良好的穩(wěn)定性與可靠性.

圖1 對(duì)照組、輻照組和質(zhì)控樣本血清LC-MS/MS數(shù)據(jù)的PCA得分散點(diǎn)圖Fig.1 PCA score scatter plot of LC-MS/MS data from serum samples of Ctrl group,IR groups,and QC samples

2.3.2正交偏最小二乘-判別分析

OPLS-DA模型的解釋率R2Y(cum)為0.717，預(yù)測(cè)率Q2(cum)為0.276，其得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2(a)，對(duì)照組和三個(gè)輻照組的血清樣本分離趨勢(shì)非常明顯，表明輻照早期的血清樣本中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的代謝發(fā)生了較為明顯的紊亂；而不同劑量的輻照組血樣樣本仍不能較好區(qū)分. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該OPLS-DA模型對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的區(qū)分程度較低，預(yù)測(cè)率較低，不能夠完全區(qū)分不同劑量的輻照組早期血清樣本.

因此，鑒于不同劑量的輻照組血清樣本不能完全區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)將10 Gy、30 Gy和10 Gy×3輻照組合并組成輻照組建立OPLS-DA模型. 模型的解釋率R2Y(cum)為0.892，預(yù)測(cè)率Q2(cum)為0.833，模型解釋率R2Y和預(yù)測(cè)率Q2都較高，能很好地解釋和預(yù)測(cè)兩組樣本間的差異. 該模型包括了1個(gè)第一主成分的預(yù)測(cè)成分和2個(gè)正交主成分?jǐn)M合得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2(b). 對(duì)照組分布比較緊湊，輻照組分部較為分散，表明對(duì)照組與輻照組血清早期樣本的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)代謝譜存在差異，可以較好地區(qū)分. 對(duì)模型采用200次響應(yīng)置換檢驗(yàn)，R2Y值構(gòu)成的回歸線截距為0.39，Q2構(gòu)成的回歸線截距為-1.93，通過(guò)隨機(jī)排序計(jì)算所得的R2(cum)和Q2(cum)值小于原始值，表明原模型可很好地解釋不同組樣本之間的差異. 同時(shí)隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的Q2逐漸下降，提示原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象.

圖2 PCA得分散點(diǎn)圖Fig.2 PCA score scatter plots

2.4 差異神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的篩選

采用變量性重要投影(variable importance in the projection,VIP)這一指標(biāo)進(jìn)行差異性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的篩選. 基于不同輻照組間OPLS-DA模型分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)篩選出14個(gè)VIP值均大于1.0的重要差異神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)(圖3)，包括酪胺、谷氨酸、高香草酸、腎上腺素、5-羥吲哚乙酸、半胱氨酸、天冬氨酸、亞精胺、多巴胺、谷胱甘肽、精胺、鳥氨酸、乙酰膽堿、褪黑素，它們都是對(duì)OPLS-DA模型中分組貢獻(xiàn)較大的變量，同時(shí)結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析t-test中的p<0.05. 本實(shí)驗(yàn)共篩選到乙酰膽堿、褪黑素、谷氨酸和酪胺4種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，它們是指示電離輻射致腦損傷潛在的生物標(biāo)志物.

圖3 血清樣本中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)代謝譜的S形曲線圖Fig. 3 S-plot of neurochemicals metabolic profiles in two groups of rat serum samples

2.5 差異性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)可能的代謝通路

將差異性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行映射，并整理出14個(gè)差異性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)映射的所有代謝通路(圖4). 結(jié)果表明，健康對(duì)照組與輻照組大鼠間的差異神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)總共映射出了34個(gè)相關(guān)代謝通路，其中5個(gè)代謝通路的Impact值大于0.5，是本實(shí)驗(yàn)所要研究的重要代謝通路，值得進(jìn)一步關(guān)注. 它們分別是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine,aspartate and glutamate metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine,serine and threonine metabolism)以及D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)途徑. 表明這些代謝途徑在全腦輻照過(guò)程中受到了擾動(dòng)，可能是與輻照致神經(jīng)損傷過(guò)程密切相關(guān)的代謝通路. 代謝通路富集分析和富集分析的氣泡圖中，每個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝通路，橫坐標(biāo)代表該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮?，縱坐標(biāo)和氣泡的顏色代表富集分析的P值，顏色越深，表示P值越小，即富集程度越顯著.

圖4 差異性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的代謝通路富集分析和拓?fù)浞治鰵馀輬DFig.4 Bubble plot for metabolic pathway enrichment analysis andtopology analysis of the differential neurochemicals

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在前期建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法基礎(chǔ)上，對(duì)60Co γ射線全腦輻照暴露下神經(jīng)損傷大鼠的血清樣本進(jìn)行了基于靶向代謝組學(xué)策略的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. 血清樣本中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)單變量統(tǒng)計(jì)分析表明，全腦輻照大鼠血清中絕大多數(shù)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)隨著輻照劑量增大含量降低，其中去甲腎上腺素、乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、酪胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、褪黑素、α-丙氨酸和甘氨酸在10 Gy、30 Gy及10 Gy×3輻照組中的含量均顯著低于對(duì)照組血清樣本，而3個(gè)輻照組中乙酰膽堿和褪黑素的含量均顯著高于對(duì)照組，表明接受全腦輻照后，血清中的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)代謝譜發(fā)生了紊亂. 另外，通過(guò)進(jìn)行30 Gy和10 Gy×3輻照組的單變量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，分次累積輻照較同等劑量單次輻照對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)造成的擾動(dòng)程度低，其中具有顯著性差異的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)包括去甲腎上腺素、乙酰膽堿、酪胺、谷氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、褪黑素、α-丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸. 通過(guò)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析，本實(shí)驗(yàn)建立的OPLS-DA模型較好地區(qū)分了對(duì)照組和輻照組的血清樣本，篩選到了VIP>1和p<0.05的4種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，即乙酰膽堿、谷氨酸、酪胺和褪黑素，它們是對(duì)模型分類貢獻(xiàn)較大的變量，可作為全腦輻照誘導(dǎo)神經(jīng)損傷潛在的生物標(biāo)志物.