張瑞麗，錢云，楊靜逸

（云南舜喜再生醫(yī)學(xué)工程有限公司，云南昆明 650106）

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）是構(gòu)成染色體的重要組成部分[1]。基因組DNA中含有生物體所有的遺傳信息，隨著生物技術(shù)的發(fā)展以及深入的研究，各種基因工程技術(shù)已在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧等領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用[2-3]。

DNA測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究中是必要的手段之一。本實(shí)驗(yàn)將DNA置于silica膜中保存不同的時(shí)間，通過對(duì)比保存不同時(shí)間的DNA結(jié)構(gòu)完整性，得出DNA在加水立柱中可保存時(shí)間，為DNA長(zhǎng)途運(yùn)輸極限時(shí)間提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

抗凝全血樣使用EDTA二鈉抗凝管采集，并置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器及試劑

無核酸污染的Tip頭、無水乙醇，生工生物工程（上海）股份有限公司；1 kb DNA Ladder（Dye Plus）和6×Loading Buffer，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；UltrapowerTM核酸染料，北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

MICROCL 17/17R 高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；VORTEX-GENIE?2漩渦混合器，美國(guó)Scientific Industries公司；單道可調(diào)精準(zhǔn)移液器，美國(guó)RAININ?；AxyPrep血基因組DNA試劑盒，江蘇康寧；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific公司；G：BOX F3凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人全血DNA提取方法

采用AxyPrep血基因組DNA試劑盒對(duì)采集的血液樣本進(jìn)行DNA提取，在silica膜中央加入100 μL的ddH2O洗脫DNA。

1.2.2 DNA濃度及完整性測(cè)定

取1 μL的DNA樣本用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度（A260/A280）；取 1 μL的 DNA、0.21 μL的6×Loading Buffer、1 μL的1%核酸染料混合液點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（1%瓊脂糖凝膠，電壓120 V，時(shí)間40 min），用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，檢測(cè)基因組完整性。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分為加封口膜（F）和無封口膜（NF）兩組，每組樣品分別在24 ℃、相對(duì)濕度為54%環(huán)境下保存0 d、6 d、10 d、14 d、18 d、20 d、22 d 及 24 d時(shí)測(cè)定其濃度、完整性及剩余體積，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以第0 d作為對(duì)照組。每次測(cè)完濃度和點(diǎn)樣完成，將洗脫至收集管內(nèi)的DNA樣品吸出并重新注入silica膜中央。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[4]，依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖片判斷基因組完整性[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取結(jié)果

按照試劑盒使用說明書對(duì)新鮮的血液樣本進(jìn)行DNA提取，F(xiàn)組基因組的濃度均值為42.9 ng/μL，NF組為41.3 ng/μL。如圖1所示，與DNA Marker片段相比，除樣品條帶外未出現(xiàn)任何條帶，提取樣品的DNA片段無斷裂、無外源核酸污染、分子大小相同，完整性較好。

圖1 新鮮血液的DNA電泳結(jié)果

2.2 封口處理對(duì)DNA濃度、純度及剩余體積的影響

2.2.1 DNA濃度

封口處理對(duì)DNA濃度隨時(shí)間變化的影響如圖2所示，可以看到隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)和NF兩組DNA的濃度均呈上升趨勢(shì)，且NF組上升的速率明顯高于F組。

圖2 封口處理對(duì)不同保存時(shí)間DNA溶液濃度的影響

2.2.2 DNA剩余體積及純度

封口處理對(duì)DNA剩余體積及純度隨時(shí)間變化的影響如圖3和圖4所示。從圖中可看出，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)和NF組DNA的剩余體積均呈下降趨勢(shì)，NF組下降的速率明顯高于F組，第20 d時(shí)，NF組溶液剩余體積已達(dá)最低值，F(xiàn)組可持續(xù)至第24 d。F組DNA溶液損失程度較小，DNA保存液體積下降速率為12.6%/d，NF組DNA保存液體積下降速率為21.8%/d，較F組損失多。兩個(gè)處理組的DNA純度（A260/A280）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 封口處理對(duì)不同保存時(shí)間DNA溶液剩余體積的影響

圖4 封口處理對(duì)不同保存時(shí)間DNA純度的影響

2.2.3 封口處理對(duì)DNA完整性的影響規(guī)律

分別將第6 d、10 d、14 d、18 d、20 d、22 d和24 d的DNA電泳結(jié)果與第0 d作比較，發(fā)現(xiàn)兩種處理間DNA完整性在同一時(shí)間無差異，3個(gè)重復(fù)之間無明顯差別。第10 d起DNA條帶附近出現(xiàn)輕微拖帶現(xiàn)象（圖5），表明有部分DNA已斷裂；第18 d時(shí)拖帶現(xiàn)象明顯，說明DNA降解加重，但仍有明顯主帶（圖6）；第24 d時(shí)，拖帶現(xiàn)象較第18 d嚴(yán)重，說明DNA降解加劇，此時(shí)主帶有模糊現(xiàn)象，但仍可見主帶（圖7）。

圖5 封口處理第10天DNA電泳結(jié)果

圖6 封口處理第18天DNA電泳結(jié)果

圖7 封口處理第24天DNA電泳結(jié)果

3 討論

基因組DNA由不同的含氮堿基按照堿基配對(duì)原則形成序列，構(gòu)成了控制生物體各種蛋白質(zhì)合成表達(dá)以及物種遺傳信息的遺傳密碼[1]。

對(duì)患者進(jìn)行相關(guān)疾病的致病基因檢測(cè)/篩查，有助于疾病病因的確立并提前示警，通過改善生活習(xí)慣和飲食規(guī)律來預(yù)防和避免疾病的發(fā)生[6]。血液作為臨床診斷和基礎(chǔ)研究中常規(guī)采集的樣本，具有較大的參考價(jià)值。從全血中提取DNA是多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步，DNA樣本提取后若不能及時(shí)檢測(cè)或者檢測(cè)條件不夠必須儲(chǔ)藏時(shí)，儲(chǔ)藏條件對(duì)DNA樣本的完整性影響值得研究。

由于剩余體積接近最低值終止實(shí)驗(yàn)，故本研究未探索至DNA完全降解或降解至不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。研究使用100 μL的ddH2O洗脫DNA，試劑盒最大洗脫體積為200 μL，所以DNA的起始濃度和體積對(duì)其在silica膜上室溫保存時(shí)間的影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

DNA結(jié)構(gòu)的完整性僅與保存時(shí)間有關(guān)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，保存在silica膜上的DNA隨著體積的減少濃度上升，DNA純度變化則不顯著，DNA在第10 d開始降解，第24 d降解嚴(yán)重但仍有主帶，可用于后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。NF組與F組體積到達(dá)最低可檢測(cè)時(shí)分別為保存第20 d和第24 d，說明室溫下silica膜上的DNA可至少保存24 d。用于長(zhǎng)距離運(yùn)輸時(shí)，在收集管口加封口膜可延長(zhǎng)保存時(shí)間并可避免外源污染。