王欣格，方佳琪，朱彩云，劉童童，張耀廣，李玉華

（鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450044）

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）最早是1938年Mann在進(jìn)行牛血細(xì)胞分離研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初稱為血銅蛋白，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它具有催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，因此將其命名為SOD[1]。SOD是一類金屬酶，在生物體內(nèi)分布非常廣泛，根據(jù)SOD酶中所含金屬輔基的不同，SOD可以被分為含銅、鋅超氧歧化酶（Cu/Zn-SOD），含鐵超氧歧化酶（Fe-SOD），含錳超氧歧化酶（Mn-SOD）三類[2]，各類SOD在不同的細(xì)胞中的定位不同，但都是核基因編碼，其中高等植物體內(nèi)以Cu/Zn-SOD為主。有不少研究表明，在脅迫條件下，植物體內(nèi)SOD等酶的活性與其抗氧化能力呈正相關(guān)，可以作為植物抗逆性強(qiáng)弱鑒定的指標(biāo)[3]。

SOD是生物體內(nèi)一類非常重要的防止氧化損傷的酶類，是重要的生物體內(nèi)氧自由基清除劑之一，可以有效平衡機(jī)體內(nèi)自由基含量，因此SOD在抗氧化、抗腫瘤、抗衰老以及對(duì)抗細(xì)胞凋亡等方面具有非常重要的作用[4]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)出現(xiàn)的含SOD化妝品有多種，如大寶SOD蜜、SOD復(fù)合酶美容面霜等。SOD作為食品中添加的抗氧化劑已被申請(qǐng)專利，貴州農(nóng)學(xué)院也已開(kāi)發(fā)出相關(guān)的刺梨SOD飲料[5]。

地黃[Rehmania glutinosa(Gaertn.) Libosch.]屬玄參科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)藥材之一，具有很強(qiáng)的藥用價(jià)值。本研究旨在克隆地黃SOD基因，為后續(xù)研究SOD基因的時(shí)空表達(dá)及探索地黃SOD新功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

地黃金九（03-2）植株，取自河南省武陟縣農(nóng)科種業(yè)有限公司地黃試驗(yàn)田。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑，美國(guó)Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、克隆載體pMD-T、RT-PCR試劑盒，日本TaKaRa公司。

高速冷凍離心機(jī)，Sigma；Nanodrop 2000分光光度計(jì)，德國(guó)Thermo；凝膠成像儀，Bio-rad；核酸電泳儀，Bio-rad；微量移液器，Eppendorf。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取及RT-PCR

采摘地黃葉片后立即液氮速凍，嚴(yán)格按照Trizol試劑手冊(cè)說(shuō)明方法進(jìn)行總RNA的提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取的質(zhì)量。經(jīng)DNase處理，去除基因組DNA，參照TAKARA公司的RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

1.3.2 SOD基因的克隆

根 據(jù) NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的毛果楊、甘薯、豌豆和蓮的SOD基因 序 列（EF405967.1、KT199019.1、AB087845.1、DQ223864.1），設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物序列Primer1（P1）和Primer2（P2），見(jiàn)表 1。

以地黃的cDNA為模板，以引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶后膠回收，連接pMD19-T Vector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后挑取白色菌斑，經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 SOD基因生物信息學(xué)分析

將得到的地黃SOD核苷酸序列用NCBI在線軟件推導(dǎo)出編碼的氨基酸序列，用DNAMAN軟件對(duì)地黃SOD基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用Computer pI/Mw Tool在線軟件（www.expasy.org）計(jì)算地黃SOD蛋白的等電點(diǎn)及其相對(duì)分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃SOD基因的克隆

提取的地黃葉片總RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰（圖1），且28S條帶亮度約是18S條帶亮度的2倍，分光光度計(jì)測(cè)定所提取RNA的OD260/OD280值為1.92，這說(shuō)明分離得到的地黃葉片總RNA比較完整，質(zhì)量較好，可以做反轉(zhuǎn)錄的模板。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，在分子量略小于500 bp的位置出現(xiàn)清晰的特異條帶（圖2），該條帶大小與已知植物的SOD大小相近，初步推測(cè)所擴(kuò)增片段為地黃SOD基因片段。

圖1 地黃總RNA電泳圖

圖2 SOD片段的PCR擴(kuò)增

2.2 生物信息學(xué)分析擴(kuò)增出的地黃SOD基因序列

測(cè)序分析得到的地黃SOD基因片段是一個(gè)包含459 bp開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列，該序列對(duì)應(yīng)編碼152個(gè)氨基酸。采用DNAMAN軟件對(duì)地黃SOD基因的核苷酸和氨基酸序列與毛果楊、豌豆、甘薯和蓮的SOD序列進(jìn)行同源性分析，核苷酸同源性分別為81.70%、76.69%、80.17%和76.47%，氨基酸序列同源性分別為85.53%、78.29%、82.89%和67.11%（圖3A），表明克隆得到的片段為SOD基因，地黃的SOD基因在植物體內(nèi)結(jié)構(gòu)上是保守的。用軟件ProtParam分析地黃SOD蛋白的分子量為1.5346×104、等點(diǎn)電為6.00，與其他植物SOD的理論等電點(diǎn)基本一致，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，用ProScale分析SOD氨基酸序列為親水性。

圖3 地黃SOD氨基酸序列同源（A）、功能結(jié)構(gòu)域（B）和二級(jí)結(jié)構(gòu)（C）分析

表1 引物序列

通 過(guò)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對(duì)地黃SOD氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖3B所示，地黃SOD包含SOD結(jié)構(gòu)域，屬于超氧化物歧化酶蛋白家族。通過(guò)SOPMA預(yù)測(cè)SOD氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3C所示，地黃SOD由54.61%的無(wú)規(guī)則卷曲、30.26%的延伸鏈、9.21%的β-轉(zhuǎn)角和5.92%的α-螺旋組成。

3 結(jié)論

克隆得到的基因?yàn)榈攸SSOD基因，該基因?qū)?yīng)蛋白屬于非跨膜的非分泌性親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)具有54.61%的無(wú)規(guī)則卷曲、30.26%的延長(zhǎng)鏈、9.21%的β-轉(zhuǎn)角和5.92%的α-螺旋，與其他植物的SOD基因序列組成、蛋白性質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面均具有高度相似性。本研究為過(guò)量表達(dá)地黃的SOD基因來(lái)提高地黃的抗氧化損傷作用奠定了基礎(chǔ)。