李佳凝，龍虎，蔡自建，陳月娉，李艷陽，周晨昕，付昊

（西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

多糖是由多個單糖縮合而成的多聚物，具有多種功能活性 ，在自然界廣泛存在[1]。熟地黃最早記載于《本草圖經(jīng)》，是玄參科植物。熟地黃多糖（Rehmannia glutinosapolysaccharide，RGP）是有生物活性的中草藥提取物之一，具有提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力、抗焦慮以及降低血糖等作用。

目前，針對該多糖的抗疲勞作用研究已取得了部分進(jìn)展，但對于熟地黃多糖在動物機(jī)體內(nèi)較長時間的作用規(guī)律和動態(tài)變化趨勢還鮮見報道。為全面探討熟地黃多糖的生理活性，本實驗對熟地黃多糖的抗疲勞作用及其動態(tài)變化進(jìn)行研究，以期為熟地黃多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然熟地黃多糖和昆明種健康小鼠的來源及要求見文獻(xiàn)[2]；乳酸（LAC）測試盒和尿素氮（BUN）試劑盒，南京建成生物研究所；蒽酮，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

DSPT-208段式大鼠跑臺，中國杭州段式儀器制作；2102C紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 劑量設(shè)計

動物飼養(yǎng)條件、分組及劑量設(shè)計均按文獻(xiàn)[2]所述進(jìn)行；實驗條件的選擇和方法的設(shè)計參照文獻(xiàn)[3]中“保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法”。

飼養(yǎng)條件：溫度（23±1）℃，相對濕度（60±5）%，明暗周期12 h，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。小鼠于實驗環(huán)境條件下適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組30只，分別為實驗組（低、中、高劑量組）和對照組。實驗組連續(xù)每天灌胃給予150 mg/kg、300 mg/kg、550 mg/kg熟地黃多糖，對照組給予等量蒸餾水。小鼠灌胃體積為0.1 mL/10 g，灌胃期間自由攝食和飲水。

1.2.2 平板跑步實驗

采用疲勞儀在最后灌胃6天內(nèi)對小鼠進(jìn)行跑步訓(xùn)練。第一、二天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練（條件：跑速15 m/min，訓(xùn)練15 min，電擊耐受時間3 s，刺激電流1.5 mA，難度低），第三、四天正規(guī)訓(xùn)練（15 m/min，30 min，3 s，1.5 mA，難度中），第五、六天加強(qiáng)訓(xùn)練（15 m/min，60 min，3 s，1.5 mA，難度高），每天訓(xùn)練一次。每次訓(xùn)練前3 h灌胃，自由取食。第28天時，末次給藥后30 min，進(jìn)行力竭訓(xùn)練（20 m/min，120 min，3 s，1.5 mA，難度中），記錄在力竭訓(xùn)練過程中小鼠所受電擊次數(shù)。

1.2.3 血乳酸及尿氮素含量測定

力竭訓(xùn)練結(jié)束后，立即于小鼠眼眶取血0.2 mL，并于45°斜面靜置至自然凝固后，4 000 r/min離心15 min，分離出血清于4 ℃環(huán)境下保存，當(dāng)天測定。測定指標(biāo)的所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 肝糖原測定

末次給小鼠受試物30 min后，立即進(jìn)行脫臼致死處理，取小鼠肝臟采用冷生理鹽水清洗，然后用濾紙吸干，并于-20 ℃環(huán)境下保存待測。精確稱取待測肝臟200 mg置入研缽中，于研缽中加入5% 三氯乙酸（TCA）8 mL，研磨待測肝臟呈糊狀勻漿，將糊狀勻漿置于低溫冷凍離心機(jī)中，在4 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液1 mL，加95%乙醇4 mL，用蒽酮法測肝糖原含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件處理，采用成組方差檢驗及t檢驗的方法，結(jié)果以折線圖或柱狀圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RGP對小鼠電擊次數(shù)的影響

RGP對小鼠所受電擊次數(shù)的影響圖見圖1。圖1表明，在14 d、21 d、28 d時，連續(xù)服用低、中、高劑量RGP的小鼠，其所受電擊次數(shù)均明顯低于對照組（P＜0.05）；中劑量組所受電擊次數(shù)顯著低于低、高劑量組（P＜0.01）；隨著時間的延長，對照組和各劑量組小鼠所受電擊次數(shù)均有一定程度的下降。

圖1 RGP對小鼠所受電擊次數(shù)的影響圖

2.2 RGP抗疲勞的效果

2.2.1 RGP對小鼠血清乳酸含量的影響

RGP對小鼠血清乳酸含量的影響圖見圖2。如圖2所示，連續(xù)服用14 d時，低劑量組的乳酸含量與空白組無顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組的乳酸含量均極顯著低于空白組（P＜0.001），中劑量組的乳酸含量顯著低于高劑量組（P＜0.01）；連續(xù)服用21 d時，低、中、高劑量組的乳酸含量均極顯著低于空白組（P＜0.01），中劑量組的乳酸含量顯著低于低、高劑量組（P＜0.01），低、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用28 d時，低、中、高劑量組的乳酸含量均與空白組均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 RGP對小鼠血清乳酸含量的影響圖

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d的RGP時，中、高劑量組均起到顯著降低乳酸的作用，高劑量組降低乳酸效果最好；連續(xù)服用21 d的RGP時，低、中、高劑量組均起到降低乳酸的作用，中劑量組降低乳酸效果最好；連續(xù)服用28 d的RGP時，各劑量組的RGP降低乳酸作用均不明顯。

2.2.2 RGP對小鼠血清尿素氮含量的影響

RGP對小鼠血清尿素氮含量的影響圖見圖3。如圖3所示，連續(xù)服用14 d時，低劑量組BUN含量顯著低于空白組（P＜0.05），中、高劑量組BUN含量極顯著低于空白組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用21 d時，低、中、高劑量組BUN含量均極顯著低于空白組（P＜0.001），中、高劑量組BUN含量極顯著低于低劑量組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；在28 d時，實驗組BUN的含量與空白組相比差異極顯著（P＜0.001），中、高劑量組BUN含量與低劑量組差異顯著（P＜0.05），中、高劑量組間差異不明顯（P＞0.05）。

圖3 RGP對小鼠血清尿素氮含量的影響圖

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d的RGP時，低、中、高劑量組均起到顯著降低BUN的作用，高劑量組降低BUN效果最好；連續(xù)服用21 d的RGP時，低、中、高劑量組均起到極顯著降低BUN的作用，中劑量組降低BUN效果最好；連續(xù)服用28 d的RGP時，低、中、高劑量組均起到極顯著降低BUN的作用，中劑量組降低BUN效果最好。

2.2.3 RGP對小鼠肝糖原含量的影響

RGP對小鼠肝糖原含量的影響圖見圖4。如圖4所示，連續(xù)服用14 d時，低劑量組與空白組的肝糖原含量無明顯差異（P＞0.05），中劑量組肝糖原含量顯著高于空白組（P＜0.05），高劑量組肝糖原含量極顯著高于空白組（P＜0.001），高劑量組肝糖原含量極顯著高于低、中劑量組（P＜0.01），低劑量與中劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用21 d時，低劑量組與空白組的肝糖原含量無明顯差異（P＞0.05），中、高劑量組肝糖原含量極顯著高于空白組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用28 d時，低劑量組與空白組差異明顯（P＜0.05），而中、高劑量組與空白組相比差異極明顯（P＜0.001），中、高劑量組差異不明顯（P＞0.05）。

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d和21 d的RGP時，低劑量的RGP增加肝糖原作用不明顯，中等劑量組和高劑量的RGP具有顯著增加小鼠肝糖原含量的作用，并且中劑量組增加效果最佳；連續(xù)服用28 d時，低、中、高劑量RGP均具有增加肝糖原含量的作用，且中劑量組效果最佳。

圖4 RGP對小鼠肝糖原含量的影響圖

3 討論

運(yùn)動性疲勞是由運(yùn)動本身所引起的運(yùn)動能力暫時降低，并使身體和精神狀態(tài)下降，從而導(dǎo)致工作效率和工作能力下降，但經(jīng)過適當(dāng)時間休息和調(diào)整可以恢復(fù)的生理現(xiàn)象。疲勞的最主要表現(xiàn)是運(yùn)動耐力的下降，因此本實驗選擇平板跑步實驗對小鼠的運(yùn)動耐力進(jìn)行測試，記錄小鼠從奔跑至力竭過程中所受電擊次數(shù)，小鼠受到的電擊次數(shù)可以反映其軀體的疲勞程度，運(yùn)動耐力的提高直接表現(xiàn)為受到電擊次數(shù)的下降。實驗結(jié)果表明，服用低、中、高劑量RGP的小鼠隨著時間的延長，所受電擊次數(shù)均有顯著下降，其中中劑量組效果最佳。在給予RGP初期，低、高劑量組小鼠的實驗效果均弱于中劑量組，這可能是因為劑量過低導(dǎo)致RGP在小鼠體內(nèi)尚未產(chǎn)生作用或是劑量過高使小鼠產(chǎn)生不耐受的反應(yīng)。對照組小鼠所受電擊次數(shù)也有一定程度的下降，推測有兩點(diǎn)原因：一是經(jīng)過多次的訓(xùn)練，小鼠已經(jīng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，熟悉跑步訓(xùn)練；二是小鼠的運(yùn)動耐力隨長期的訓(xùn)練得到增強(qiáng)。

當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動時，體內(nèi)細(xì)胞就會表現(xiàn)出相對缺氧，此時細(xì)胞內(nèi)糖的無氧酵解作用加劇，產(chǎn)生大量的乳酸，肌肉細(xì)胞中H+濃度增加，從而引起疲勞。因此減少乳酸的產(chǎn)生可以延緩疲勞的產(chǎn)生，運(yùn)動后乳酸含量越低，表明抗疲勞作用越強(qiáng)。機(jī)體在運(yùn)動時，糖、脂肪和蛋白質(zhì)均可以供能。當(dāng)運(yùn)動時間較短時，蛋白質(zhì)較少參與供能，血清尿素氮含量幾乎不發(fā)生變化；但當(dāng)運(yùn)動時間過長時，蛋白質(zhì)的分解代謝作用就會加強(qiáng)，體內(nèi)就會產(chǎn)生大量的尿素并進(jìn)入血液，血清尿素氮明顯增加，機(jī)體對負(fù)荷的適應(yīng)能力越差，血清尿素氮增加的越明顯。糖是肌肉活動時能量的主要來源，肌糖原消耗的同時，為保持血糖水平的穩(wěn)定，肝糖原儲備量減少。肝糖原儲備越多、合成越快，運(yùn)動持續(xù)時間越長，抗疲勞作用越強(qiáng)[4]。因此，選擇血乳酸含量、血清尿素氮含量及肝糖原儲備量作為評價熟地黃多糖是否具有抗疲勞作用的客觀指標(biāo)[5]。實驗結(jié)果表明，連續(xù)服用不同劑量的熟地黃多糖能有效降低小鼠劇烈運(yùn)動后乳酸和尿素氮的積累，同時提高肝糖原的儲備量，說明在各劑量下RGP均提高了小鼠的運(yùn)動耐力，進(jìn)而發(fā)揮了抗疲勞作用?？紤]到服用時長和服用效果，連續(xù)服用21 d 300 mg/（kg·d）的熟地黃多糖對小鼠產(chǎn)生的抗疲勞效果最佳。

4 結(jié)論

熟地黃多糖可以顯著影響與抗疲勞相關(guān)的生理生化指標(biāo)，從而降低機(jī)體疲勞的程度。本實驗研究結(jié)果表明熟地黃多糖具有較強(qiáng)的抗疲勞作用且具有明顯的量效關(guān)系，按照300 mg/（kg·d）的劑量連續(xù)服用21 d效果最佳，因此熟地黃多糖值得進(jìn)一步的開發(fā)利用。