李佳凝，龍虎，蔡自建，陳月娉，李艷陽，周晨昕，付昊

（西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

多糖是由多個(gè)單糖縮合而成的多聚物，具有多種功能活性 ，在自然界廣泛存在[1]。熟地黃最早記載于《本草圖經(jīng)》，是玄參科植物。熟地黃多糖（Rehmannia glutinosapolysaccharide，RGP）是有生物活性的中草藥提取物之一，具有提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力、抗焦慮以及降低血糖等作用。

目前，針對(duì)該多糖的抗疲勞作用研究已取得了部分進(jìn)展，但對(duì)于熟地黃多糖在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)較長時(shí)間的作用規(guī)律和動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)還鮮見報(bào)道。為全面探討熟地黃多糖的生理活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)熟地黃多糖的抗疲勞作用及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，以期為熟地黃多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然熟地黃多糖和昆明種健康小鼠的來源及要求見文獻(xiàn)[2]；乳酸（LAC）測(cè)試盒和尿素氮（BUN）試劑盒，南京建成生物研究所；蒽酮，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

DSPT-208段式大鼠跑臺(tái)，中國杭州段式儀器制作；2102C紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì)

動(dòng)物飼養(yǎng)條件、分組及劑量設(shè)計(jì)均按文獻(xiàn)[2]所述進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)條件的選擇和方法的設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[3]中“保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”。

飼養(yǎng)條件：溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，明暗周期12 h，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。小鼠于實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組30只，分別為實(shí)驗(yàn)組（低、中、高劑量組）和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組連續(xù)每天灌胃給予150 mg/kg、300 mg/kg、550 mg/kg熟地黃多糖，對(duì)照組給予等量蒸餾水。小鼠灌胃體積為0.1 mL/10 g，灌胃期間自由攝食和飲水。

1.2.2 平板跑步實(shí)驗(yàn)

采用疲勞儀在最后灌胃6天內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行跑步訓(xùn)練。第一、二天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練（條件：跑速15 m/min，訓(xùn)練15 min，電擊耐受時(shí)間3 s，刺激電流1.5 mA，難度低），第三、四天正規(guī)訓(xùn)練（15 m/min，30 min，3 s，1.5 mA，難度中），第五、六天加強(qiáng)訓(xùn)練（15 m/min，60 min，3 s，1.5 mA，難度高），每天訓(xùn)練一次。每次訓(xùn)練前3 h灌胃，自由取食。第28天時(shí)，末次給藥后30 min，進(jìn)行力竭訓(xùn)練（20 m/min，120 min，3 s，1.5 mA，難度中），記錄在力竭訓(xùn)練過程中小鼠所受電擊次數(shù)。

1.2.3 血乳酸及尿氮素含量測(cè)定

力竭訓(xùn)練結(jié)束后，立即于小鼠眼眶取血0.2 mL，并于45°斜面靜置至自然凝固后，4 000 r/min離心15 min，分離出血清于4 ℃環(huán)境下保存，當(dāng)天測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)的所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 肝糖原測(cè)定

末次給小鼠受試物30 min后，立即進(jìn)行脫臼致死處理，取小鼠肝臟采用冷生理鹽水清洗，然后用濾紙吸干，并于-20 ℃環(huán)境下保存待測(cè)。精確稱取待測(cè)肝臟200 mg置入研缽中，于研缽中加入5% 三氯乙酸（TCA）8 mL，研磨待測(cè)肝臟呈糊狀勻漿，將糊狀勻漿置于低溫冷凍離心機(jī)中，在4 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液1 mL，加95%乙醇4 mL，用蒽酮法測(cè)肝糖原含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用成組方差檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)的方法，結(jié)果以折線圖或柱狀圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RGP對(duì)小鼠電擊次數(shù)的影響

RGP對(duì)小鼠所受電擊次數(shù)的影響圖見圖1。圖1表明，在14 d、21 d、28 d時(shí)，連續(xù)服用低、中、高劑量RGP的小鼠，其所受電擊次數(shù)均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；中劑量組所受電擊次數(shù)顯著低于低、高劑量組（P＜0.01）；隨著時(shí)間的延長，對(duì)照組和各劑量組小鼠所受電擊次數(shù)均有一定程度的下降。

圖1 RGP對(duì)小鼠所受電擊次數(shù)的影響圖

2.2 RGP抗疲勞的效果

2.2.1 RGP對(duì)小鼠血清乳酸含量的影響

RGP對(duì)小鼠血清乳酸含量的影響圖見圖2。如圖2所示，連續(xù)服用14 d時(shí)，低劑量組的乳酸含量與空白組無顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組的乳酸含量均極顯著低于空白組（P＜0.001），中劑量組的乳酸含量顯著低于高劑量組（P＜0.01）；連續(xù)服用21 d時(shí)，低、中、高劑量組的乳酸含量均極顯著低于空白組（P＜0.01），中劑量組的乳酸含量顯著低于低、高劑量組（P＜0.01），低、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用28 d時(shí)，低、中、高劑量組的乳酸含量均與空白組均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 RGP對(duì)小鼠血清乳酸含量的影響圖

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d的RGP時(shí)，中、高劑量組均起到顯著降低乳酸的作用，高劑量組降低乳酸效果最好；連續(xù)服用21 d的RGP時(shí)，低、中、高劑量組均起到降低乳酸的作用，中劑量組降低乳酸效果最好；連續(xù)服用28 d的RGP時(shí)，各劑量組的RGP降低乳酸作用均不明顯。

2.2.2 RGP對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響

RGP對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響圖見圖3。如圖3所示，連續(xù)服用14 d時(shí)，低劑量組BUN含量顯著低于空白組（P＜0.05），中、高劑量組BUN含量極顯著低于空白組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用21 d時(shí)，低、中、高劑量組BUN含量均極顯著低于空白組（P＜0.001），中、高劑量組BUN含量極顯著低于低劑量組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；在28 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組BUN的含量與空白組相比差異極顯著（P＜0.001），中、高劑量組BUN含量與低劑量組差異顯著（P＜0.05），中、高劑量組間差異不明顯（P＞0.05）。

圖3 RGP對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響圖

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d的RGP時(shí)，低、中、高劑量組均起到顯著降低BUN的作用，高劑量組降低BUN效果最好；連續(xù)服用21 d的RGP時(shí)，低、中、高劑量組均起到極顯著降低BUN的作用，中劑量組降低BUN效果最好；連續(xù)服用28 d的RGP時(shí)，低、中、高劑量組均起到極顯著降低BUN的作用，中劑量組降低BUN效果最好。

2.2.3 RGP對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

RGP對(duì)小鼠肝糖原含量的影響圖見圖4。如圖4所示，連續(xù)服用14 d時(shí)，低劑量組與空白組的肝糖原含量無明顯差異（P＞0.05），中劑量組肝糖原含量顯著高于空白組（P＜0.05），高劑量組肝糖原含量極顯著高于空白組（P＜0.001），高劑量組肝糖原含量極顯著高于低、中劑量組（P＜0.01），低劑量與中劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用21 d時(shí)，低劑量組與空白組的肝糖原含量無明顯差異（P＞0.05），中、高劑量組肝糖原含量極顯著高于空白組（P＜0.001），中、高劑量組間無顯著差異（P＞0.05）；連續(xù)服用28 d時(shí)，低劑量組與空白組差異明顯（P＜0.05），而中、高劑量組與空白組相比差異極明顯（P＜0.001），中、高劑量組差異不明顯（P＞0.05）。

結(jié)果表明：連續(xù)服用14 d和21 d的RGP時(shí)，低劑量的RGP增加肝糖原作用不明顯，中等劑量組和高劑量的RGP具有顯著增加小鼠肝糖原含量的作用，并且中劑量組增加效果最佳；連續(xù)服用28 d時(shí)，低、中、高劑量RGP均具有增加肝糖原含量的作用，且中劑量組效果最佳。

圖4 RGP對(duì)小鼠肝糖原含量的影響圖

3 討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是由運(yùn)動(dòng)本身所引起的運(yùn)動(dòng)能力暫時(shí)降低，并使身體和精神狀態(tài)下降，從而導(dǎo)致工作效率和工作能力下降，但經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間休息和調(diào)整可以恢復(fù)的生理現(xiàn)象。疲勞的最主要表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)耐力的下降，因此本實(shí)驗(yàn)選擇平板跑步實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力進(jìn)行測(cè)試，記錄小鼠從奔跑至力竭過程中所受電擊次數(shù)，小鼠受到的電擊次數(shù)可以反映其軀體的疲勞程度，運(yùn)動(dòng)耐力的提高直接表現(xiàn)為受到電擊次數(shù)的下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，服用低、中、高劑量RGP的小鼠隨著時(shí)間的延長，所受電擊次數(shù)均有顯著下降，其中中劑量組效果最佳。在給予RGP初期，低、高劑量組小鼠的實(shí)驗(yàn)效果均弱于中劑量組，這可能是因?yàn)閯┝窟^低導(dǎo)致RGP在小鼠體內(nèi)尚未產(chǎn)生作用或是劑量過高使小鼠產(chǎn)生不耐受的反應(yīng)。對(duì)照組小鼠所受電擊次數(shù)也有一定程度的下降，推測(cè)有兩點(diǎn)原因：一是經(jīng)過多次的訓(xùn)練，小鼠已經(jīng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，熟悉跑步訓(xùn)練；二是小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力隨長期的訓(xùn)練得到增強(qiáng)。

當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)細(xì)胞就會(huì)表現(xiàn)出相對(duì)缺氧，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)糖的無氧酵解作用加劇，產(chǎn)生大量的乳酸，肌肉細(xì)胞中H+濃度增加，從而引起疲勞。因此減少乳酸的產(chǎn)生可以延緩疲勞的產(chǎn)生，運(yùn)動(dòng)后乳酸含量越低，表明抗疲勞作用越強(qiáng)。機(jī)體在運(yùn)動(dòng)時(shí)，糖、脂肪和蛋白質(zhì)均可以供能。當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間較短時(shí)，蛋白質(zhì)較少參與供能，血清尿素氮含量幾乎不發(fā)生變化；但當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間過長時(shí)，蛋白質(zhì)的分解代謝作用就會(huì)加強(qiáng)，體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量的尿素并進(jìn)入血液，血清尿素氮明顯增加，機(jī)體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)能力越差，血清尿素氮增加的越明顯。糖是肌肉活動(dòng)時(shí)能量的主要來源，肌糖原消耗的同時(shí)，為保持血糖水平的穩(wěn)定，肝糖原儲(chǔ)備量減少。肝糖原儲(chǔ)備越多、合成越快，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間越長，抗疲勞作用越強(qiáng)[4]。因此，選擇血乳酸含量、血清尿素氮含量及肝糖原儲(chǔ)備量作為評(píng)價(jià)熟地黃多糖是否具有抗疲勞作用的客觀指標(biāo)[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)服用不同劑量的熟地黃多糖能有效降低小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后乳酸和尿素氮的積累，同時(shí)提高肝糖原的儲(chǔ)備量，說明在各劑量下RGP均提高了小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，進(jìn)而發(fā)揮了抗疲勞作用?？紤]到服用時(shí)長和服用效果，連續(xù)服用21 d 300 mg/（kg·d）的熟地黃多糖對(duì)小鼠產(chǎn)生的抗疲勞效果最佳。

4 結(jié)論

熟地黃多糖可以顯著影響與抗疲勞相關(guān)的生理生化指標(biāo)，從而降低機(jī)體疲勞的程度。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明熟地黃多糖具有較強(qiáng)的抗疲勞作用且具有明顯的量效關(guān)系，按照300 mg/（kg·d）的劑量連續(xù)服用21 d效果最佳，因此熟地黃多糖值得進(jìn)一步的開發(fā)利用。