賈偉，方志鵬，武發(fā)竹，李霞

（合肥工業(yè)大學(xué) 土木與水利工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

近年來，藻華一直是困擾人類的環(huán)境問題，同時微藻也在生物柴油等各大領(lǐng)域都得到了應(yīng)用[1]。微藻具有環(huán)境適應(yīng)性好和光合效率高等優(yōu)點，利用廢水對微藻進(jìn)行培養(yǎng)，不僅可以去除廢水中的污染物，達(dá)到改善水質(zhì)的目的，還可以將培養(yǎng)所得的微藻應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。但是相對細(xì)菌等微生物來說，微藻生長較為緩慢，如何提高微藻的生長速率是待解決的一大難題。本實驗以小球衣藻和污泥細(xì)菌共培養(yǎng)為研究對象，通過測定微藻的生物量和培養(yǎng)液中氮磷的含量，探究有機(jī)碳在菌藻共培養(yǎng)中對微藻生長的影響，以期為藻華治理和污水處理等方面提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球衣藻（Chlamydomonas microsphaera），從中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫-淡水藻種庫（中國武漢）處購買，編號為FACHB-52；污泥細(xì)菌，取自合肥市朱磚井污水處理廠。

LIVE/DEAD染液（SYTO9染料0.33 mmol/L、碘化丙啶（PI）2 mmol/L），賽默飛世爾科技；黑色聚碳酸酯濾膜，上海力敏實業(yè)有限公司；丙酮、鹽酸、氨基磺酸、抗壞血酸、鉬酸銨、硫酸、酒石酸銻鉀、葡萄糖、蔗糖，均為國藥分析純。

Centrifuge5804高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；BDP-250二氧化碳人工氣候箱，上海百典儀器有限公司；IX73+DP倒置顯微鏡，日本Olympus公司；LX-650-L高壓滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV2600紫外分光光度計，Unico（上海）儀器有限公司。

1.2 實驗設(shè)計

實驗環(huán)境為恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，實驗條件的溫度控制在（25±1）℃范圍內(nèi)，光照強(qiáng)度設(shè)置為2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h。

實驗組：準(zhǔn)備4個體積為500 mL的玻璃錐形瓶[編號為1、2、3、4，內(nèi)裝有250 mL相同的且到達(dá)對數(shù)生長期的微藻（0.54×106cells/mL）]，向編號1、2、3、4錐形瓶中各加入2.4 mL的細(xì)菌（8.5×108cells/mL），保證初始的菌藻個數(shù)比約為15∶1。每天向編號2錐形瓶中加入0.01 g葡萄糖，向編號3錐形瓶中加入0.02 g葡萄糖，向編號4錐形瓶中加入0.05 g葡萄糖，同樣將葡萄糖替換為蔗糖進(jìn)行相同實驗。

對照組：與實驗組相比，除了不加入細(xì)菌，其余條件完全相同。

1.3 微藻生物量的測定

取10 mL樣品于50 mL離心管中，在8 000 r/min下離心10 min，然后棄去上清液，將剩余物重新懸浮在10 mL的丙酮中，在4 ℃冰箱下避光保存24 h。最后再以8 000 r/min離心10 min，收集離心后所得上清液后，采用紫外分光光度法測定630 nm、645 nm、663 nm和750 nm波長下的光密度，空白對照為丙酮溶液，葉綠素a的濃度（μg/L）由公式（1）求得：

式（1）中：C（Chl-a）為葉綠素a的濃度，μg/L；V為提取體積，L；OD為λ波長處的光密度，nm[2]。

得到葉綠素a的含量后，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線將葉綠素a的濃度換算成微藻的細(xì)胞數(shù)。每個樣品都需要3個相同的平行樣品，以此減小實驗所帶來的誤差。

1.4 硝態(tài)氮和總磷的測定

從反應(yīng)器中取3 mL樣品于5 mL的離心管中，再通過0.22 μm的濾頭過濾后留作備測，取1 mL備測樣品于50 mL比色管中，然后使用超純水將備測樣品稀釋至標(biāo)線處，先加入1 mL配好的1 mol/L的鹽酸，再加入0.1 mL已配置好的8%的氨基磺酸溶液，分別在220 nm和275 nm波長處測量吸光度，硝酸鹽氮的含量按公式（2）計算：

式（2）中：A220為220 nm波長下的光密度；A275為275 nm波長下的光密度[3]。代入公式（2）求得A校，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得A校所對應(yīng)的硝態(tài)氮含量（mg/L）；再取1 mL備測樣品于50 mL比色管中，然后使用超純水將備測樣品稀釋至標(biāo)線處，先加入1 mL配制好的抗壞血酸溶液，再加入2 mL已配制好的鉬酸鹽溶液，測定在700 nm波長下的吸光度[3]。再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得所對應(yīng)的總磷含量（mg/L）。測試水樣若之前經(jīng)過稀釋處理，則所測結(jié)果應(yīng)乘以之前的稀釋倍數(shù)。每個樣品都需要3個平行樣品，以此來減小實驗所帶來的誤差。

1.5 細(xì)菌生物量的測定

細(xì)菌量的測定通過分子探針LIVE/DEAD細(xì)菌活性試劑盒來測定。具體操作過程為：取3 μL PI和3 μL SYTO9加入5 mL樣品中，在室內(nèi)避光30 min，將染色后的樣品通過孔徑為0.22 μm、直徑為25 mm的黑色聚碳酸酯膜，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，在200倍下對同一樣品隨機(jī)拍攝10張照片，記錄細(xì)菌數(shù)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)碳濃度下微藻的生物量

不同葡萄糖和蔗糖濃度下微藻的生物量如圖1所示。從圖1中可以看出，不投加有機(jī)碳時，菌藻共培養(yǎng)中微藻的生物量略低于純藻培養(yǎng)，說明無有機(jī)碳時細(xì)菌的存在對微藻的生長有略微的抑制作用；加入有機(jī)碳后，純藻培養(yǎng)中微藻的生物量隨著有機(jī)碳濃度的增加無顯著變化，但菌藻共培養(yǎng)中微藻的生物量隨著投加有機(jī)碳濃度的增加而顯著增加，說明有機(jī)碳和細(xì)菌共同作用可以加速微藻的生長，如在每天投加有機(jī)碳0.05 g的條件下，菌藻共培養(yǎng)中微藻的生物量從第0 d的0.53×106cells/mL增加到第6 d的（3.37～4.62）×106cells/mL，且遠(yuǎn)高于純藻培養(yǎng)組第6 d的0.93×106cells/mL。

圖1 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）濃度下微藻的生物量

2.2 不同有機(jī)碳濃度下培養(yǎng)液中氮的含量

不同葡萄糖和蔗糖濃度下培養(yǎng)液中氮的含量如圖2所示。從圖2中可以看出，菌藻共培養(yǎng)對氮的降解效果優(yōu)于純藻培養(yǎng)，當(dāng)添加有機(jī)碳后，氮的含量急劇下降，且隨著有機(jī)碳濃度的增加，氮降解速率越快，第6 d氮的含量從第0 d的22 mg/L降低到2 mg/L左右，降解率達(dá)90%以上。實驗結(jié)果表明，利用污水進(jìn)行微藻培養(yǎng)，可以有效的去除培養(yǎng)液中的氮，對污水處理具有一定的指導(dǎo)意義。

圖2 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）濃度下培養(yǎng)液中氮的含量

2.3 不同有機(jī)碳濃度下培養(yǎng)液中磷的含量

不同葡萄糖和蔗糖濃度下培養(yǎng)液中磷的含量如圖3所示。從圖3中可以看出，加入有機(jī)碳后，第1 d各組磷含量無明顯變化，第2 d開始菌藻共培養(yǎng)對磷的降解效果優(yōu)于純藻培養(yǎng)，且隨著有機(jī)碳濃度的增加，磷的降解效果提高，第6 d磷的含量從第0 d的48 mg/L降低到32 mg/L左右。磷的降解情況各組規(guī)律與氮降解情況類似，因此猜測磷的降解與氮降解存在著一定的關(guān)系，只有當(dāng)?shù)浇档偷揭欢ǔ潭葧r，磷的降解才可以進(jìn)行。

圖3 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）濃度下培養(yǎng)液中磷的含量

3 結(jié)論

菌藻共培養(yǎng)時，有機(jī)碳對微藻生長有著極大的促進(jìn)作用，且存在一定的量效關(guān)系。每天投加0.05 g的有機(jī)碳，在第6 d時，菌藻共培養(yǎng)中微藻的生物量從第0 d的0.53×106cells/mL增加到（3.37～4.62）×106cells/mL，是同條件下純藻培養(yǎng)的3～4倍。在此條件下培養(yǎng)微藻，對氮和磷都有著不同程度上的降解，第6 d對氮的降解可以達(dá)到90%以上。