汪運(yùn)洋，馬環(huán)，馮瀟磊，吳健，杜志勇，馬燾，任坤，趙猛

（北京生物制品研究所有限公司，北京 100176）

20世紀(jì)80年代，默克（Merck）公司利用改造的釀酒酵母工程菌表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原，并通過生物反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng)制備乙型肝炎疫苗[1]，成為最早應(yīng)用重組酵母工程菌制備疫苗的成功案例。利用工程菌大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)獲得目的產(chǎn)物，成為了新型疫苗開發(fā)的趨勢(shì)。工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程多在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，通過對(duì)生物反應(yīng)器溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧、濁度等參數(shù)的控制，使微生物的基因表達(dá)及代謝調(diào)控最有利于目的產(chǎn)物的生物合成和促進(jìn)目的蛋白的累積[2]。在發(fā)酵罐體積相對(duì)固定的條件下，活菌數(shù)量與細(xì)胞代謝、產(chǎn)物合成緊密相關(guān)，如果不能全面了解細(xì)胞增殖與代謝之間復(fù)雜關(guān)系的影響因子，就很難重復(fù)與控制細(xì)胞生產(chǎn)過程和目的產(chǎn)物的合成[3]。因此，本文利用電容法在酵母發(fā)酵過程中進(jìn)行活菌細(xì)胞數(shù)量的在線監(jiān)測(cè)，并探索發(fā)酵過程活菌細(xì)胞數(shù)量和代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

工程菌種及發(fā)酵培養(yǎng)基，北京生物制品研究所乙肝疫苗室；ZETA750生物反應(yīng)器，ZETA公司；INCYTE活細(xì)胞數(shù)密度監(jiān)測(cè)儀，HAMILTON公司。

1.2 酵母工程菌的擴(kuò)增

酵母工程菌菌液由北京生物制品研究所乙肝疫苗室提供，于適應(yīng)溫度和時(shí)間等條件下經(jīng)錐形瓶、種子罐和生產(chǎn)罐進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)獲得。

1.3 INCYTE-活細(xì)胞數(shù)密度監(jiān)測(cè)儀的原理

如圖1所示，活細(xì)胞傳感器的檢測(cè)探頭一般分為四針式電極和四環(huán)式電極兩種，無線電頻率在100 kHz～20 MHz，傳感器電極會(huì)在培養(yǎng)液內(nèi)產(chǎn)生交叉電場(chǎng)，完整的原生質(zhì)膜細(xì)胞會(huì)發(fā)生極化，具有類似微型電容器的特性。另外一對(duì)電極收集培養(yǎng)液中的電容信號(hào)，再經(jīng)過信號(hào)放大器處理、分析計(jì)算獲得電容值[4]。

圖1 活細(xì)胞傳感儀的電極

1.4 培養(yǎng)過程細(xì)胞傳感儀監(jiān)測(cè)參數(shù)的設(shè)定

目前，研究者們已成功在20余種菌體發(fā)酵過程中應(yīng)用活細(xì)胞傳感器在線采集數(shù)據(jù)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了菌體濃度的校正模型，不同細(xì)胞類型的檢測(cè)頻率、菌體濃度的校正模型和電導(dǎo)率變化范圍如表1所示。

表1 不同細(xì)胞類型的檢測(cè)頻率、菌體濃度校正模型和電導(dǎo)率變化[5]

使用INCYTE-活細(xì)胞數(shù)密度監(jiān)測(cè)儀，記錄酵母發(fā)酵工程菌過程中的電容值變化，參考表1數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置。首先將儀器電極插入生物反應(yīng)器監(jiān)測(cè)探頭預(yù)留孔中，加入發(fā)酵培養(yǎng)基后121 ℃滅菌30 min，在發(fā)酵培養(yǎng)開始前連接信號(hào)放大器進(jìn)行監(jiān)測(cè)參數(shù)設(shè)置，電容頻率分別設(shè)定為465 kHz、578 kHz、680 kHz和 897 kHz，數(shù)據(jù)記錄頻次為3 min/次。將酵母工程菌加入生物反應(yīng)器，在固定攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、溶氧等參數(shù)的前提下，進(jìn)行酵母工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)，同時(shí)啟動(dòng)濁度探頭在線監(jiān)測(cè)OD280。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電容檢測(cè)頻率對(duì)酵母菌校正模型監(jiān)測(cè)的影響

不同細(xì)胞類型檢測(cè)頻率、菌體濃度校正模型可能存在一定的差異，因此本實(shí)驗(yàn)選取4個(gè)頻率同時(shí)在線檢測(cè)，對(duì)比不同檢測(cè)頻率下酵母活菌電容值曲線的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，4種頻率下酵母活菌電容值趨勢(shì)基本一致，檢測(cè)值無明顯差異。

圖2 不同電容頻率下酵母活菌電容值趨勢(shì)圖

2.2 發(fā)酵過程中OD280趨勢(shì)檢測(cè)

分別進(jìn)行A組、B組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，A組接菌后初始OD280值為4.13，B組接種后初始OD280值為3.51。A組、B組發(fā)酵過程OD280檢測(cè)趨勢(shì)如圖3所示。從圖3可知，OD280檢測(cè)值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，兩組細(xì)胞趨勢(shì)相同，培養(yǎng)結(jié)束OD280值略有差異，這與酵母細(xì)胞初始接種量差異有關(guān)。

圖3 發(fā)酵過程OD280監(jiān)測(cè)值趨勢(shì)圖

2.3 電容頻率680 kHz下電容值監(jiān)測(cè)趨勢(shì)

以表1酵母菌監(jiān)測(cè)電容頻率為參考，本試驗(yàn)選擇電容頻率680 kHz條件下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，酵母活菌電容監(jiān)測(cè)值在發(fā)酵培養(yǎng)過程的0～20 h隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，從20 h至培養(yǎng)結(jié)束，酵母活菌電容值保持穩(wěn)定，無明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。A組和B組發(fā)酵過程中電容值變化趨勢(shì)基本一致。

圖4 電容頻率680 kHz下發(fā)酵過程電容值監(jiān)測(cè)趨勢(shì)圖

3 結(jié)論與討論

大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中用到的生物反應(yīng)器，一般通過在線監(jiān)測(cè)溫度、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、OD值、pH值等參數(shù)，達(dá)到控制或監(jiān)控生產(chǎn)的目的。在生產(chǎn)中，準(zhǔn)確的反應(yīng)活細(xì)胞量對(duì)細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)過程控制有著非常重要的指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)的活細(xì)胞測(cè)定方法依靠取樣離線檢測(cè)，如染色后顯微鏡計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)等。取樣過程不僅增加了發(fā)酵培養(yǎng)基被污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還有操作復(fù)雜、檢測(cè)結(jié)果滯后等缺點(diǎn)。

活細(xì)胞在線監(jiān)測(cè)電極可與發(fā)酵罐同時(shí)在線滅菌，無需取樣離線檢測(cè)即可獲得發(fā)酵過程各階段準(zhǔn)確的活細(xì)胞數(shù)量，為培養(yǎng)過程活菌數(shù)量變化的監(jiān)控提供高效、科學(xué)的監(jiān)測(cè)手段。

本文通過利用電容法在線監(jiān)測(cè)酵母發(fā)酵過程活菌細(xì)胞數(shù)量，初步發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸趨于平衡，但OD280值持續(xù)增加。說明在有限培養(yǎng)體積和有限培養(yǎng)物質(zhì)的前提下，控制細(xì)胞濃度可以有目的性的選擇促進(jìn)細(xì)胞代謝和表達(dá)代謝產(chǎn)物的時(shí)間，從而為酵母工程菌發(fā)酵過程中目的代謝產(chǎn)物的優(yōu)化控制提供新的思路。