黃艷麗，王曉軍，夏夢薇，張穎，翟立紅，肖娟，劉佩軍

（湖北文理學院 醫(yī)學部，湖北襄陽 441053）

程序性細胞死亡因子5（Programmed Cell Death Factor 5，PDCD5）是程序性細胞死亡蛋白家族成員，原名稱為TF-1細胞凋亡相關(guān)基因19（TF-1 cell apoptosis related gene 19，TFAR19），2002年 國 際人類基因命名委員會將其統(tǒng)一命名為PDCD5，主要表達于睪丸、腎上腺、結(jié)腸等組織。目前研究表明，PDCD5基因與凋亡密切相關(guān)，當存在誘導凋亡因素時，PDCD5蛋白的表達增多，并且從細胞漿中轉(zhuǎn)移，向細胞核內(nèi)積聚，能夠顯著產(chǎn)生抑制增殖和促進細胞凋亡的作用。梁婷婷等研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5與存活素在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)負相關(guān)，其可作為一種抑癌因子參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[1]。胥丹等研究發(fā)現(xiàn)PDCD5和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase-3）聯(lián)合表達可抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡，有望作為治療肝癌的潛在靶點[2]。劉宏峰等[3]通過對腎細胞癌（RCC）的研究，發(fā)現(xiàn)PDCD5通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響腎細胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT轉(zhuǎn)化），負調(diào)控RCC病人的侵襲與轉(zhuǎn)移進程。以上研究表明，PDCD5能夠促進多種腫瘤細胞凋亡，是一個潛在的新抑癌基因，但其作用機制仍不明確，尚待深入分子層面研究其功能及機制。

如今，在生物大數(shù)據(jù)背景下，可以利用生物信息學手段對基因進行預測和分析，更加全面的了解一個基因。本文對PDCD5進行生物信息學和多態(tài)性進行分析，旨在更全面地認識PDCD5基因。

1 材料與方法

1.1 材料

人PDCD5基因的核酸序列、氨基酸序列以及基因的外顯子序列等基本信息從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取，且以此為生物信息學分析的數(shù)據(jù)；隨機抽取湖北省內(nèi)128例健康人群為研究對象并取得知情同意，清晨收集口腔唾液，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

采用SOPMA在線工具預測人PDCD5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；選用TMHMM Server v.2.0在線軟件對PDCD5進行跨膜區(qū)域分析；運用PSORT II軟件預測人PDCD5蛋白的亞細胞定位；通過NetPhos 3.1 Server在線工具預測人PDCD5蛋白的磷酸化位點；從NCBI網(wǎng)站獲取人類PDCD5基因在不同組織中的表達預測；利用繪圖軟件制作出PDCD5基因結(jié)構(gòu)圖與染色體位置。

1.2.2 基因多態(tài)性分析

（1）DNA提取。使用唾液基因組DNA提取試劑盒（天根）提取DNA，置于-20 ℃?zhèn)溆谩＃?）PCR擴增和測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST功能設計兩個SNP位點的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

隨后利用提取的DNA進行PCR擴增，總體系為50 μL（DNA 2 μL，引物分別 2.5 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O 16 μL），PCR程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性，30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物8 μL經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出目的條帶的樣品寄往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（武漢）進行單向測序。最后對所有樣本的測序結(jié)果利用Bioedit軟件進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人PDCD5跨膜區(qū)和亞細胞定位預測

選用TMHMM Server v.2.0軟件工具對PDCD5跨膜區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)人PDCD5蛋白并不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，由此推測該蛋白可能是非跨膜蛋白。采用軟件工具PSORT II對人PDCD5蛋白的亞細胞定位進行預測與分析，結(jié)果表明人PDCD5蛋白有43.5%位于細胞核，30.4%位于細胞質(zhì)，17.4%位于線粒體，8.7%位于細胞骨架。

2.2 人PDCD5基因染色體位置、基因結(jié)構(gòu)圖

從NCBI上獲取PDCD5基因的信息，利用繪圖軟件制作出PDCD5基因結(jié)構(gòu)圖（圖1）。其染色體位置在19q13.11，基因全長6 265 bp，含有6個外顯子、5個內(nèi)含子，可編碼125個氨基酸，等電點為5.77。

圖1 人PDCD5基因染色體位置和基因結(jié)構(gòu)圖

2.3 人PDCD5二級結(jié)構(gòu)預測

選用SOPMA在線軟件工具預測分析人PDCD5蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，人PDCD5蛋白二級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列中α-螺旋（Hh）為62.40%，β-轉(zhuǎn)角（Tt）為1.60%，無規(guī)卷曲（Cc）為27.20%，延伸鏈（Ee）為8.80%。從組成數(shù)據(jù)可以看出，該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件為α-螺旋和無規(guī)卷曲。

2.4 預測人PDCD5的磷酸化位點

利用NetPhos 3.1 Server在線軟件預測人PDCD5蛋白的磷酸化位點，人PDCD5蛋白有多個磷酸化位點，但只有6個絲氨酸、5個蘇氨酸和2個酪氨酸的磷酸化能力超過了閾值，表明人PDCD5蛋白共有13個磷酸化位點。

2.5 人PDCD5在不同組織中的表達預測

從NCBI網(wǎng)站獲取人類PDCD5基因在不同組織中的表達預測（圖2），圖中得分越高表明蛋白質(zhì)含量越多。可以看到人PDCD5基因在睪丸、腎上腺、脂肪、結(jié)腸等組織中表達量較高，在胰腺、唾腺等組織中表達量較少，這為接下來進一步研究PDCD5基因提供了基礎。

圖2 人PDCD5在不同組織的表達量圖

2.6 人PDCD5基因的多態(tài)性分析

通過NCBI網(wǎng)站，找到PDCD5基因存在兩個Clinical SNP位點，分別是rs75015964（G＞A）與rs76303011（G＞A/G＞T）。其中rs75015964（G＞A）位于該基因的第一外顯子，具體染色體位置為chr19:32581307（GRCh38.p12），會造成 PDCD5蛋白的錯義變異（16 E[GAG]＞K[AAG]），另一個位點rs76303011（G＞A/G＞T）位于該基因的第一內(nèi)含子，具體染色體位置為chr19:32584943（GRCh38.p12）。為了檢測這兩個Clinical SNP位點在湖北人群中的多態(tài)性，提取了128例湖北人群的唾液DNA進行PCR產(chǎn)物的3730測序，結(jié)果表明該位點在湖北人群中不存在多態(tài)性，基因型均為rs75015964（G）與rs76303011（G），說明該基因在湖北人群中具有高度的保守性（圖3）。

圖3 SNP位點（rs76303011）在部分樣本中的PCR擴增結(jié)果、序列比對和位點測序結(jié)果

3 結(jié)論

PDCD5基因編碼的蛋白由125個氨基酸組成，定位于細胞核和細胞質(zhì)，少部分定位于線粒體和細胞骨架，該基因進化相對保守且表達譜較為寬泛。在人類多種組織中均有表達，主要表達于睪丸、腎上腺、結(jié)腸等組織，在胚胎組織中的表達均遠低于成年人的組織。

rs75015964（G＞ A） 與 rs76303011（G＞ A/G＞T）是人PDCD5基因的兩個Clinical SNP位點，NCBI網(wǎng)站顯示rs75015964（G＞A）G等位基因在全球的等位基因頻率為0.99940，A為0.00060，在歐洲、非洲人群中，G等位基因頻率分別為0.99952和0.993，A分別為0.00048和0.007，而在亞洲、東亞、南亞人群中，G等位基因頻率均為1，A均為0；rs76303011（G＞A/G＞T）位點G等位基因在全球的等位基因頻率為0.99665，A為0.00335，在歐洲、非洲人群中，G等位基因頻率分別為0.9985和0.975，A分別為0.0015和0.025，而在亞洲、東亞、南亞人群中，G等位基因頻率均為1，A均為0。本研究結(jié)果中顯示這兩個Clinical SNP位點在湖北人群中不存在多態(tài)性，和網(wǎng)上報道的一致，說明這兩個Clinical SNP位點在湖北乃至亞洲人群中沒有臨床檢測意義，但是從另一方面來看，該基因的序列保守程度高，說明了該基因功能的重要性，也暗示該基因的啟動子結(jié)合上游轉(zhuǎn)錄因子對基因的功能起著重要的調(diào)控作用，具有深入研究的價值。