韋正，張鵬，寧東元，寧廷婷，魯世明，張暉英

（1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西河池 546300；2.韓山師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東潮州 521041）

地桃花為錦葵科植物肖梵天花（Urena lobataLinn.）的干燥地上部分[1]，是成方制劑花紅片、花紅顆粒、花紅膠囊的主藥之一[2]，在我國(guó)主要分布于福建、廣東、四川、云南和廣西等地區(qū)。地桃花主要含有黃酮、木質(zhì)素、酚酸、揮發(fā)油類等成分[3]，其中以黃酮類成分為主，并含有銀鍛苷、木犀草素、芹菜素、山柰酚以及蘆丁等化合物[4-5]。《中國(guó)植物志》記載其常用于治療痢疾、急性腸炎[1]，具有抗炎[6]作用，也可用于治療淋巴結(jié)結(jié)核[7]，對(duì)于利尿、解熱、治療風(fēng)濕病或咳嗽均有效果[3]，且有利膽、強(qiáng)心的療效[8]。廣西和云南等少數(shù)民族地區(qū)以地桃花葉入藥，地桃花具有抗氧化活性和廣譜抗菌作用，且毒副作用較小。

地桃花葉中的黃酮為其主成分之一，而以銀椴苷含量較高，可作為質(zhì)量控制指標(biāo)。在藥理方面，銀椴苷具有顯著的降血糖和抗氧化等作用。本研究以銀鍛苷、總黃酮含量、DPPH自由基清除率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)及信息熵理論多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法[9-13]，優(yōu)化地桃花葉醇提取工藝，并篩選出最佳提取條件，以期為地桃花葉的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

地桃花葉購(gòu)自廣西宜州市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)河池學(xué)院覃國(guó)樂(lè)副教授鑒定為錦葵科梵天花屬植物肖梵天花的地桃花（Urena lobataLinn.）的葉。

1.2 試劑與儀器

磷酸、乙酸銨、三氯化鋁、乙醇、甲醇、石油醚，分析純，西隴化工股份有限公司；2,2-二（4-叔辛基）-1-苦肼基，分析純，美國(guó)Sigma公司；乙腈，色譜純，美國(guó)天地；蘆?。ㄅ?hào)MUST-15091104）、銀鍛苷（批號(hào)MUST-16061202）對(duì)照品，純度＞98%，成都曼斯特生物有限公司。

Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀（SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A檢測(cè)器、LC solution色譜工作站），日本島津公司；Agilent 8453紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，美國(guó)Agilent公司；Millipore D-Q3超純水一體機(jī)，賽恩斯儀器有限公司；ME204E型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-52AA系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；WKH-1.7-A型熱風(fēng)循環(huán)烘箱，青島市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥材預(yù)處理

將地桃花葉適當(dāng)剪碎，自然陰干，于50 ℃烘箱中恒溫烘干后用粉碎機(jī)打粉，過(guò)80目網(wǎng)篩，再用石油醚（沸程60～90 ℃）回流脫脂，進(jìn)行多次脫色至石油醚無(wú)色，過(guò)濾，藥材于50 ℃烘干，裝袋備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

稱取適量銀椴苷對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋銀椴苷質(zhì)量濃度為0.033 mg/mL；稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加70%乙醇稀釋成濃度為0.336 mg/mL。置于4 ℃的冰箱中保存，待用。

1.3.3 供試品溶液制備

稱取地桃花葉樣品粉末0.5 g置于圓底燒瓶中，加入75%乙醇60 mL，密塞，稱定質(zhì)量，于水浴鍋回流提取90 min后，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，補(bǔ)重?fù)u勻，提取液以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：Inertsustain AQ-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈（B）、0.05%磷酸溶液（A）；梯度洗脫（0～5 min，15%～22% B；5～8 min，22% ～ 27% B；8～ 25 min，27% ～ 40% B；25～ 30 min，40% ～ 50% B；30～ 40 min，50%～100% B；40～45 min，100%～100% B）；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：315 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣器：10 μL。

1.3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、15 μL混合對(duì)照品溶液，按“1.3.4”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。根據(jù)對(duì)照品濃度（C）和對(duì)照品峰面積（A）進(jìn)行線性回歸。

1.3.6 精密度考察

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“1.3.4”項(xiàng)下進(jìn)樣6次，測(cè)得銀椴苷的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.3.7 重復(fù)性考察

按照“1.3.3”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，分別按“1.3.4”項(xiàng)下進(jìn)樣6次，測(cè)得銀椴苷的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.3.8 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h分別通過(guò)液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得銀椴苷峰面積，計(jì)算RSD值。

1.3.9 加樣回收試驗(yàn)

取待測(cè)液6份，精密分別加入一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“1.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別按“1.3.4”項(xiàng)下進(jìn)樣6次，測(cè)得加樣回收率，計(jì)算RSD值。

1.3.10 總黃酮含量測(cè)定

三氯化鋁-乙酸鹽法準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL的容量瓶中，加入70%的乙醇溶液至5 mL，加2 mL pH=5.5的乙酸銨緩沖液，之后加入4 mL 1.5%的三氯化鋁溶液，用70%的乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，靜置30 min后，在415 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[10-14]。樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，依次測(cè)定總黃酮的含量。

1.3.11 DPPH自由基清除率的測(cè)定

現(xiàn)配0.02 mg/mL的DPPH溶液。精密移取0.5 mL待測(cè)樣品溶液，加甲醇稀釋至1 mL，再加入DPPH工作液6 mL，充分搖勻，在避免光照的條件下靜置30 min，于517 nm處依次測(cè)量，按公式（1）計(jì)算清除率（I）[10-14]。

1.3.12 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

如表1所示，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，以溫度、乙醇濃度、時(shí)間、料液比為要素，選擇L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，2次平行試驗(yàn)，分別以地桃花葉中的銀椴苷、總黃酮提取率、DPPH自由基清除率作為考察指標(biāo)[10-15]，擬合信息熵進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表（n=2）

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相指紋圖譜

地桃花葉供試液按照“1.2.4”條件進(jìn)樣分析，銀椴苷出峰時(shí)間為26.3 min，色譜峰分離度好，分離度大于1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 銀椴苷特征峰

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

銀椴苷0.066～0.495 μg/μL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=2 856 220.0141X+4 506.3798，R2=0.9998。精密度考察峰面積RSD為0.12%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性考察峰面積RSD值為2.1%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性考察峰面積RSD值為0.19%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。加樣回收率試驗(yàn)中測(cè)得加樣回收率為95.12%，RSD為1.4%。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)線性方程計(jì)算地桃花葉中銀椴苷的含量、總黃酮的提取率以及DPPH自由基清除率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果（n=2）

2.3.1 基于信息熵賦權(quán)的正交試驗(yàn)分析

經(jīng)過(guò)對(duì)地桃花的銀椴苷含量、總黃酮含量、自由基清除率的計(jì)算，根據(jù)文獻(xiàn)給出的步驟[11-13]，建立以銀椴苷含量、總黃酮含量和自由基清除率為指標(biāo)的矩陣（X）：

將原始矩陣轉(zhuǎn)換為概率矩陣(Pij)mn，其中，Pij表示第j次實(shí)驗(yàn)在i指標(biāo)下的概率。根據(jù)公式（1）計(jì)算Pij，將初始矩陣轉(zhuǎn)化為“概率”矩陣（P）：

計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵（Hi），將得到評(píng)價(jià)指標(biāo)的（Hi）：

計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)（Wi）:

綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3，即銀椴苷含量、總黃酮含量、自由基清除率各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)依次為0.0211、0.9668、0.0121。

2.3.3 正交試驗(yàn)方差分析

采用信息熵加權(quán)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3分析來(lái)看，影響提取效率的因素大小依次為A＞B＞D＞C，即溫度＞濃度＞料液比＞時(shí)間。時(shí)間對(duì)結(jié)果沒(méi)有顯著性影響。綜合結(jié)果分析可知，最優(yōu)提取條件為A3B2C2D2，即回流提取溫度為95 ℃，乙醇濃度75%，提取時(shí)間為120 min，料液比1∶60（g∶mL）。

表3 方差分析

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件，平行進(jìn)行5份驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，銀椴苷的平均含量為0.118 11 mg/g，RSD值為0.12%；總黃酮的平均含量為25.27448 mg/g，RSD值為0.42%；DPPH自由基清除率平均值為為82.79%，RSD值為0.67%；綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)M平均值為2.458 07，RSD值為0.37%。該結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說(shuō)明此工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

以地桃花葉為研究對(duì)象，引入信息熵對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以銀椴苷的醇提得率、總黃酮的提取率、自由基清除率作為參考指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為提取溫度95 ℃，乙醇濃度75%，提取時(shí)間120 min，料液比1∶60（g∶mL）, 銀椴苷的含量為0.11837 mg/g,總黃酮的含量為25.22430 mg/g。