在食品安全導(dǎo)向下，社會(huì)大眾對(duì)奶制品安全的重視程度顯著提高。分析牛奶出現(xiàn)質(zhì)量問題的核心誘因，微生物污染首當(dāng)其中?？偟膩砜矗Ｄ讨械募?xì)菌來源渠道不外乎奶牛自體患病、擠奶、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)汝P(guān)節(jié)。但即使在規(guī)范、合規(guī)的牛奶生產(chǎn)程序中，發(fā)生微生物污染的可能性仍然較高。為了加強(qiáng)牛奶質(zhì)量管控，應(yīng)采取恰當(dāng)?shù)氖侄畏椒?，即分子生物法，探究市面牛奶中的?xì)菌菌群。

一、資料與方法

1.基礎(chǔ)資料。樣品采集：選擇市面超市在售的4個(gè)牛奶品牌的5類牛奶，即30天常溫保質(zhì)期的高溫滅菌奶、2-6℃7天保質(zhì)期的巴氏消毒牛奶，然后將這些牛奶樣品標(biāo)記為A、B、C、D、E的名稱。其中，A、B、C樣品屬性為高溫滅菌類，D、E樣品則為巴氏滅菌類，且C、D為同一品牌廠家生產(chǎn)的常溫奶及巴氏奶，各個(gè)牛奶樣品的采集皆為一個(gè)批次。

試劑型號(hào)：本次研究中運(yùn)用了DNA Stool試劑盒、Cycle-Pure試劑盒、Trans DH5α細(xì)胞、SYBR?FASTqPCR試劑盒。

儀器設(shè)備：在本次研究中所應(yīng)用到的儀器設(shè)備有：GeneAmp PCR System光度計(jì)、Allgre X-22R離心機(jī)、PowerPac Basic電泳儀等。

2.方法。（1）提取DNA。采取Collado等方法，選擇100mL的牛奶，精準(zhǔn)提取其中7150×g的細(xì)菌DNA，在離心20min后，去除樣品表層溶液，對(duì)底部沉淀物進(jìn)行采集，并使用5mL的TE（1×）再次進(jìn)行懸浮沉淀處理。應(yīng)用DNA提取專用試劑盒，對(duì)沉淀物的DNA加以提取。提前準(zhǔn)備50?L規(guī)模的TE（1×），將已收獲的DNA提取物置入其中充分溶解。使用分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，同時(shí)選用1%濃度的瓊脂糖凝膠開展電泳檢測(cè)工作，提取片段DNA，最后將樣品放置在-20℃恒溫的冰箱內(nèi)冷藏保存。

（2）對(duì)16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。承載338F-CCTACGGGAGGCAGCAG及534R-ATTACCGCGGCTGCTG對(duì)16s rRNA-v3區(qū)施以擴(kuò)增，獲得PremixTapVersion2.010L的PCR反應(yīng)式。具體反應(yīng)條件有：一是5min、95℃的預(yù)變處理;二是30s、94℃的變性處理;三是30s、5℃的退火處理;四是40min、紫外光的電泳條帶觀察等。然后運(yùn)用純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物加以純化處理，及時(shí)測(cè)量其質(zhì)量濃度，收獲純化物。

（3）分析基因序列。比對(duì)測(cè)序序列，當(dāng)MAX indent超出98%后，需及時(shí)記載相對(duì)應(yīng)序列的對(duì)標(biāo)細(xì)菌署名及起末位點(diǎn)。依照一致位點(diǎn)，操作BioEdit軟件程序，對(duì)所獲得的序列進(jìn)行16S rRNA-v3區(qū)的二次擴(kuò)增，并引用ClustalX（1.83）比對(duì)序列。以H表示菌屬序列數(shù)在全部均屬總數(shù)中的百分比占比，通過1-ΣH2客觀評(píng)價(jià)各個(gè)樣品中的DNA多樣性。

（4）PCR定量細(xì)菌總數(shù)。PCR定量曲線的獲取可以質(zhì)粒為憑證，需將其施以10倍梯度的標(biāo)準(zhǔn)化稀釋，具體反應(yīng)系為：SYBR?Green Master Mix（2×）10?L。

二、結(jié)果

1.牛奶DNA提取及PCR擴(kuò)增。本次試驗(yàn)完成了15個(gè)樣品DNA的細(xì)菌基因組提取，分析電泳結(jié)果，DNA展現(xiàn)出了彌散狀，且不具備主帶。在開展PCR擴(kuò)增處理后，可收獲到190bp的片段，對(duì)照后發(fā)現(xiàn)其并無增條帶。

在保證各個(gè)品牌牛奶皆可參與克隆試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，隨即抽取了5個(gè)擴(kuò)增物展開T-A克隆操作。各個(gè)樣品均獲得了不少于1000個(gè)的克隆，并再次隨即選擇了100個(gè)克隆物參加測(cè)序。

2.牛奶樣品內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)。以16S rRNA現(xiàn)有基因數(shù)量為判斷牛奶樣品中細(xì)菌數(shù)的載體，分析結(jié)果為：全部樣品中皆帶有一定數(shù)量的基因片段。因各類細(xì)菌內(nèi)均含有2-15個(gè)的16S rRNA基因拷貝數(shù)，所以本次試驗(yàn)圍繞絕對(duì)定量信息數(shù)據(jù)展開了最大化以及最小化的二次處理，并依照國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，如圖1所示。利用最少細(xì)菌的基因拷貝數(shù)結(jié)算其最多持有的細(xì)菌總數(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品中的最大細(xì)菌數(shù)仍然未超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

3.菌種判斷分析。對(duì)最終隨即抽選的5個(gè)樣品的克隆加以測(cè)序，得到了16S rRNA-V3區(qū)的472條序列。其中，A樣品為93條序列，包括21種不同序列;B樣品為92條序列，包括27種不同序列;C樣品為95條序列，包括41種不同序列;D樣品為96條序列，包括51種不同序列;E樣品為95條序列，包括30種不同序列。

經(jīng)菌屬鑒定，這些基因序列中共有452條可精準(zhǔn)定位到5個(gè)細(xì)菌綱、17個(gè)細(xì)菌屬，即占比12%的芽孢桿菌綱、占比82%的β-變形菌綱、占比3%的黃桿菌綱、占比1%的放線菌綱、占比2%的γ-變形菌綱。

4.牛奶細(xì)菌的多樣性。本次試驗(yàn)中，牛奶樣品可定位到屬的有A-E，分別為5、5、11、8、8個(gè)，其間差異較大。為進(jìn)一步掌握樣品的細(xì)菌多樣性，針對(duì)其序列開展了多樣性的專項(xiàng)分析，結(jié)果見表1所示。結(jié)果顯示，C、D樣品的菌群多樣性明顯超出了A、B樣品。

三、討論

1.16S rRNA-V3區(qū)的克隆測(cè)序判斷細(xì)菌菌群。通過分子生物學(xué)的科學(xué)方法使用提取樣品中的細(xì)菌DNA，并對(duì)其加以細(xì)化分析，兼顧PCR序列擴(kuò)增等多元手段剖析樣品的菌群多樣性及細(xì)菌結(jié)構(gòu)，是現(xiàn)階段國內(nèi)外分子試驗(yàn)研究中的常用模式。本次研究中，使用試劑盒提取牛奶樣品的細(xì)菌DNA，并對(duì)其施以PCR序列擴(kuò)增，成功收獲了PCR產(chǎn)物。再進(jìn)行T-A克隆及測(cè)序工作，得到了試驗(yàn)所用的5種牛奶樣品的16S rRNA-V3的詳細(xì)性序列信息，并對(duì)其信息數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合比較、判斷。結(jié)果顯示，該方法的標(biāo)準(zhǔn)操作能夠提取市面牛奶的細(xì)菌DNA，且這些基因組可用于后續(xù)的下游試驗(yàn)。

2.牛奶細(xì)菌總數(shù)較大。本次試驗(yàn)表明，雖然樣品牛奶內(nèi)含的細(xì)菌總量均未超出國家安全標(biāo)準(zhǔn)，但比較國外105個(gè)/mL規(guī)格的細(xì)菌總量標(biāo)準(zhǔn)，樣品細(xì)菌總數(shù)仍處于高水平。而這一現(xiàn)象的產(chǎn)生原因，或許可歸結(jié)于我國奶源大多來自于散養(yǎng)戶，在飼料、衛(wèi)生、養(yǎng)殖等方面的管理不當(dāng)，從而導(dǎo)致生奶細(xì)菌數(shù)難以控制，且長(zhǎng)期儲(chǔ)存待售也可致使細(xì)菌迅速滋生繁殖。對(duì)此，我國監(jiān)管部門應(yīng)加大對(duì)奶源中細(xì)菌總數(shù)的管理力度，提高奶制品質(zhì)量。

3.各品牌牛奶的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌群來講，本次試驗(yàn)中的5個(gè)樣品展現(xiàn)出了不同占比。但針對(duì)同一屬的樣品細(xì)菌而言，其在同一樣品內(nèi)呈現(xiàn)出了較強(qiáng)的細(xì)菌序列相似性，具有較近的直接親密關(guān)系。分析試驗(yàn)結(jié)果，造成牛奶樣品不同菌群結(jié)構(gòu)的原因?yàn)槟淘床町?，因奶源的不同使得其環(huán)境內(nèi)現(xiàn)存的菌群結(jié)構(gòu)不盡相同。

綜上，本次研究選擇了市面所售4個(gè)品牌的牛奶進(jìn)行16S rRNA分子生物學(xué)方法的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明樣品牛奶內(nèi)皆含有一定數(shù)量的細(xì)菌，雖然數(shù)量總量未超出國家標(biāo)準(zhǔn)，但仍需采取規(guī)范奶源管理、加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管等措施，逐步降低牛奶內(nèi)含有的細(xì)菌數(shù)，從而提高我國奶制品的質(zhì)量，確保消費(fèi)者購買到安全、健康的奶制品。

作者簡(jiǎn)介：李思佳（1987-），女，寧夏人，碩士研究生，助教，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。