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        16S rRNA分子生物學(xué)方法探究牛奶中的細(xì)菌菌群

        2021-11-07 02:40:13李思佳
        中國食品 2021年21期

        在食品安全導(dǎo)向下,社會(huì)大眾對(duì)奶制品安全的重視程度顯著提高。分析牛奶出現(xiàn)質(zhì)量問題的核心誘因,微生物污染首當(dāng)其中??偟膩砜矗D讨械募?xì)菌來源渠道不外乎奶牛自體患病、擠奶、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)汝P(guān)節(jié)。但即使在規(guī)范、合規(guī)的牛奶生產(chǎn)程序中,發(fā)生微生物污染的可能性仍然較高。為了加強(qiáng)牛奶質(zhì)量管控,應(yīng)采取恰當(dāng)?shù)氖侄畏椒?,即分子生物法,探究市面牛奶中的?xì)菌菌群。

        一、資料與方法

        1.基礎(chǔ)資料。樣品采集:選擇市面超市在售的4個(gè)牛奶品牌的5類牛奶,即30天常溫保質(zhì)期的高溫滅菌奶、2-6℃7天保質(zhì)期的巴氏消毒牛奶,然后將這些牛奶樣品標(biāo)記為A、B、C、D、E的名稱。其中,A、B、C樣品屬性為高溫滅菌類,D、E樣品則為巴氏滅菌類,且C、D為同一品牌廠家生產(chǎn)的常溫奶及巴氏奶,各個(gè)牛奶樣品的采集皆為一個(gè)批次。

        試劑型號(hào):本次研究中運(yùn)用了DNA Stool試劑盒、Cycle-Pure試劑盒、Trans DH5α細(xì)胞、SYBR?FASTqPCR試劑盒。

        儀器設(shè)備:在本次研究中所應(yīng)用到的儀器設(shè)備有:GeneAmp PCR System光度計(jì)、Allgre X-22R離心機(jī)、PowerPac Basic電泳儀等。

        2.方法。(1)提取DNA。采取Collado等方法,選擇100mL的牛奶,精準(zhǔn)提取其中7150×g的細(xì)菌DNA,在離心20min后,去除樣品表層溶液,對(duì)底部沉淀物進(jìn)行采集,并使用5mL的TE(1×)再次進(jìn)行懸浮沉淀處理。應(yīng)用DNA提取專用試劑盒,對(duì)沉淀物的DNA加以提取。提前準(zhǔn)備50?L規(guī)模的TE(1×),將已收獲的DNA提取物置入其中充分溶解。使用分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè),同時(shí)選用1%濃度的瓊脂糖凝膠開展電泳檢測(cè)工作,提取片段DNA,最后將樣品放置在-20℃恒溫的冰箱內(nèi)冷藏保存。

        (2)對(duì)16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。承載338F-CCTACGGGAGGCAGCAG及534R-ATTACCGCGGCTGCTG對(duì)16s rRNA-v3區(qū)施以擴(kuò)增,獲得PremixTapVersion2.010L的PCR反應(yīng)式。具體反應(yīng)條件有:一是5min、95℃的預(yù)變處理;二是30s、94℃的變性處理;三是30s、5℃的退火處理;四是40min、紫外光的電泳條帶觀察等。然后運(yùn)用純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物加以純化處理,及時(shí)測(cè)量其質(zhì)量濃度,收獲純化物。

        (3)分析基因序列。比對(duì)測(cè)序序列,當(dāng)MAX indent超出98%后,需及時(shí)記載相對(duì)應(yīng)序列的對(duì)標(biāo)細(xì)菌署名及起末位點(diǎn)。依照一致位點(diǎn),操作BioEdit軟件程序,對(duì)所獲得的序列進(jìn)行16S rRNA-v3區(qū)的二次擴(kuò)增,并引用ClustalX(1.83)比對(duì)序列。以H表示菌屬序列數(shù)在全部均屬總數(shù)中的百分比占比,通過1-ΣH2客觀評(píng)價(jià)各個(gè)樣品中的DNA多樣性。

        (4)PCR定量細(xì)菌總數(shù)。PCR定量曲線的獲取可以質(zhì)粒為憑證,需將其施以10倍梯度的標(biāo)準(zhǔn)化稀釋,具體反應(yīng)系為:SYBR?Green Master Mix(2×)10?L。

        二、結(jié)果

        1.牛奶DNA提取及PCR擴(kuò)增。本次試驗(yàn)完成了15個(gè)樣品DNA的細(xì)菌基因組提取,分析電泳結(jié)果,DNA展現(xiàn)出了彌散狀,且不具備主帶。在開展PCR擴(kuò)增處理后,可收獲到190bp的片段,對(duì)照后發(fā)現(xiàn)其并無增條帶。

        在保證各個(gè)品牌牛奶皆可參與克隆試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,隨即抽取了5個(gè)擴(kuò)增物展開T-A克隆操作。各個(gè)樣品均獲得了不少于1000個(gè)的克隆,并再次隨即選擇了100個(gè)克隆物參加測(cè)序。

        2.牛奶樣品內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)。以16S rRNA現(xiàn)有基因數(shù)量為判斷牛奶樣品中細(xì)菌數(shù)的載體,分析結(jié)果為:全部樣品中皆帶有一定數(shù)量的基因片段。因各類細(xì)菌內(nèi)均含有2-15個(gè)的16S rRNA基因拷貝數(shù),所以本次試驗(yàn)圍繞絕對(duì)定量信息數(shù)據(jù)展開了最大化以及最小化的二次處理,并依照國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比,如圖1所示。利用最少細(xì)菌的基因拷貝數(shù)結(jié)算其最多持有的細(xì)菌總數(shù),發(fā)現(xiàn)樣品中的最大細(xì)菌數(shù)仍然未超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

        3.菌種判斷分析。對(duì)最終隨即抽選的5個(gè)樣品的克隆加以測(cè)序,得到了16S rRNA-V3區(qū)的472條序列。其中,A樣品為93條序列,包括21種不同序列;B樣品為92條序列,包括27種不同序列;C樣品為95條序列,包括41種不同序列;D樣品為96條序列,包括51種不同序列;E樣品為95條序列,包括30種不同序列。

        經(jīng)菌屬鑒定,這些基因序列中共有452條可精準(zhǔn)定位到5個(gè)細(xì)菌綱、17個(gè)細(xì)菌屬,即占比12%的芽孢桿菌綱、占比82%的β-變形菌綱、占比3%的黃桿菌綱、占比1%的放線菌綱、占比2%的γ-變形菌綱。

        4.牛奶細(xì)菌的多樣性。本次試驗(yàn)中,牛奶樣品可定位到屬的有A-E,分別為5、5、11、8、8個(gè),其間差異較大。為進(jìn)一步掌握樣品的細(xì)菌多樣性,針對(duì)其序列開展了多樣性的專項(xiàng)分析,結(jié)果見表1所示。結(jié)果顯示,C、D樣品的菌群多樣性明顯超出了A、B樣品。

        三、討論

        1.16S rRNA-V3區(qū)的克隆測(cè)序判斷細(xì)菌菌群。通過分子生物學(xué)的科學(xué)方法使用提取樣品中的細(xì)菌DNA,并對(duì)其加以細(xì)化分析,兼顧PCR序列擴(kuò)增等多元手段剖析樣品的菌群多樣性及細(xì)菌結(jié)構(gòu),是現(xiàn)階段國內(nèi)外分子試驗(yàn)研究中的常用模式。本次研究中,使用試劑盒提取牛奶樣品的細(xì)菌DNA,并對(duì)其施以PCR序列擴(kuò)增,成功收獲了PCR產(chǎn)物。再進(jìn)行T-A克隆及測(cè)序工作,得到了試驗(yàn)所用的5種牛奶樣品的16S rRNA-V3的詳細(xì)性序列信息,并對(duì)其信息數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合比較、判斷。結(jié)果顯示,該方法的標(biāo)準(zhǔn)操作能夠提取市面牛奶的細(xì)菌DNA,且這些基因組可用于后續(xù)的下游試驗(yàn)。

        2.牛奶細(xì)菌總數(shù)較大。本次試驗(yàn)表明,雖然樣品牛奶內(nèi)含的細(xì)菌總量均未超出國家安全標(biāo)準(zhǔn),但比較國外105個(gè)/mL規(guī)格的細(xì)菌總量標(biāo)準(zhǔn),樣品細(xì)菌總數(shù)仍處于高水平。而這一現(xiàn)象的產(chǎn)生原因,或許可歸結(jié)于我國奶源大多來自于散養(yǎng)戶,在飼料、衛(wèi)生、養(yǎng)殖等方面的管理不當(dāng),從而導(dǎo)致生奶細(xì)菌數(shù)難以控制,且長(zhǎng)期儲(chǔ)存待售也可致使細(xì)菌迅速滋生繁殖。對(duì)此,我國監(jiān)管部門應(yīng)加大對(duì)奶源中細(xì)菌總數(shù)的管理力度,提高奶制品質(zhì)量。

        3.各品牌牛奶的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌群來講,本次試驗(yàn)中的5個(gè)樣品展現(xiàn)出了不同占比。但針對(duì)同一屬的樣品細(xì)菌而言,其在同一樣品內(nèi)呈現(xiàn)出了較強(qiáng)的細(xì)菌序列相似性,具有較近的直接親密關(guān)系。分析試驗(yàn)結(jié)果,造成牛奶樣品不同菌群結(jié)構(gòu)的原因?yàn)槟淘床町?,因奶源的不同使得其環(huán)境內(nèi)現(xiàn)存的菌群結(jié)構(gòu)不盡相同。

        綜上,本次研究選擇了市面所售4個(gè)品牌的牛奶進(jìn)行16S rRNA分子生物學(xué)方法的試驗(yàn)研究,結(jié)果表明樣品牛奶內(nèi)皆含有一定數(shù)量的細(xì)菌,雖然數(shù)量總量未超出國家標(biāo)準(zhǔn),但仍需采取規(guī)范奶源管理、加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管等措施,逐步降低牛奶內(nèi)含有的細(xì)菌數(shù),從而提高我國奶制品的質(zhì)量,確保消費(fèi)者購買到安全、健康的奶制品。

        作者簡(jiǎn)介:李思佳(1987-),女,寧夏人,碩士研究生,助教,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

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