馮鵬飛 郭書文 魏路路 王惠 劉云柯 魏梵域

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是嚴(yán)重的心血管疾病，病死率較高，根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告 2018》顯示，中國(guó)心血管病患病率持續(xù)上升、心血管病死亡率仍居首位[1]，其中MI是重要致死因素。心肌梗死后心力衰竭是常見(jiàn)且嚴(yán)重的合并癥，其發(fā)生發(fā)展與心室重塑、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[2]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[3]、心肌纖維化[4]及炎癥反應(yīng)[5]等參與心肌梗死相關(guān)的病理進(jìn)程，與MI后心室功能的進(jìn)展密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血藥對(duì)MI后心室功能具有保護(hù)作用，本研究將著重探討這種保護(hù)作用的發(fā)揮是否與TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)及其對(duì)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)表達(dá)的影響，為益氣活血藥防止MI后心室功能進(jìn)展障礙的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用50只健康的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量(200±20) g，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物和器材

1.2.1 藥物制備 益氣活血藥由生黃芪30 g、生曬參10 g、當(dāng)歸15 g、三七6 g、川芎15 g組成，該藥物已申請(qǐng)專利(專利申請(qǐng)?zhí)枮?201610368030.7)。中藥材從北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房購(gòu)入，根據(jù)口服水煎劑進(jìn)行制備，浸泡、煎煮、濾過(guò)、回流提取后濃縮定容，調(diào)整藥物濃度到每毫升藥液含生藥0.82 g；陽(yáng)性對(duì)照藥物培哚普利(雅施達(dá))，施維雅天津制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20034053，研磨后利用蒸餾水制備成溶液使用。

1.2.2 主要試劑和儀器 TLR4(Proteintech，貨號(hào)：19811-1-AP)、NF-κB(Abcam，貨號(hào)：Ab16502)；大鼠TNF-α(武漢華美，貨號(hào)：CSB-E11987r，96T)、大鼠MCP-1(武漢華美，貨號(hào)：CSB-E07429r，96T)、大鼠IL-6(武漢華美，貨號(hào)：CSB-E04640r，96T)檢測(cè)試劑盒；小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V8)，全景掃描儀(3DHISTECH公司，Pannoramic MIDI)，高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司，Vevo770)，電泳儀(Bio-Rad公司，Mi-PROTEAN Tetra)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行稱重，選擇體質(zhì)量(200±20) g的35只大鼠進(jìn)行造模。大鼠心肌梗死模型的制備采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending，LAD)的方法進(jìn)行[6]。麻醉用藥選擇1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、麻醉方式為腹腔注射；麻醉后對(duì)手術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮、消毒，并進(jìn)行氣管插管；逐層剪開3～4 肋間皮膚并消毒，為避免出血，肌層采取鈍性分離；經(jīng)氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，鈍性分離3、4肋間肌肉開放胸腔，將心臟從心包膜中暴漏，使用 5/0 無(wú)菌帶線縫合針在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間下2 mm 處結(jié)扎LAD及其伴行血管；結(jié)扎后心臟迅速?gòu)?fù)位，清理出血及排空氣體后閉合胸腔，逐層消毒并縫合，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔掉氣管插管。假手術(shù)與造模手術(shù)操作大致相同，但假手術(shù)只進(jìn)行穿線而不進(jìn)行結(jié)扎。為防止感染，術(shù)后青霉素鈉預(yù)防用藥，每只 20 萬(wàn)單位/天，連續(xù)用藥3天。對(duì)35只大鼠進(jìn)行造模手術(shù)，術(shù)中術(shù)后死亡6只，24只大鼠造模成功。10只進(jìn)行假手術(shù)，術(shù)中死亡2只。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

術(shù)后第二天，對(duì)存活大鼠行心電圖檢查，觀察并計(jì)數(shù)大鼠心電圖Ⅰ導(dǎo)聯(lián)、aVL導(dǎo)聯(lián)及V1-V6導(dǎo)聯(lián)中的病理性Q波，病理性Q波計(jì)數(shù)在5個(gè)以上視為造模成功[7]。獲得24只心梗大鼠進(jìn)行隨機(jī)分配，將其分別分配到模型組、培哚普利組及益氣活血組，每組8只。并利用8只假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組。術(shù)后第二天進(jìn)行給藥，連續(xù)灌胃給藥28天。給藥劑量按照臨床等效劑量進(jìn)行換算，其中益氣活血組每天給藥8.2 g/(kg·d)、培哚普利組每天給藥劑量0.4 mg/(kg·d)。假手術(shù)組和模型組每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 超聲心動(dòng)檢測(cè)大鼠左室功能 給藥28天后，對(duì)各組大鼠左心室功能進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)，觀察藥物對(duì)左室功能的影響。檢測(cè)時(shí)利用高頻探頭RMV716進(jìn)行定位，通過(guò)M模式對(duì)心室功能分析評(píng)價(jià)，采集3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期取平均值。主要檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5.2 大鼠血液和心肌組織取材 超聲結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，然后進(jìn)行心臟組織取材。血液樣本4℃狀態(tài)下自然沉淀凝固30分鐘，3000 r/min離心15分鐘，取上清-80℃保存用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)；心肌組織一部分4%多聚甲醛溶液固定處理后用于石蠟包埋切片，其余部分分離梗死邊緣區(qū)，-80℃保存用于蛋白免疫印跡檢測(cè)(Western Blot，WB)。

1.5.3 蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色) 4%多聚甲醛固定心肌組織，進(jìn)行包埋切片并進(jìn)行HE染色，全景掃描顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像。

1.5.4 WB檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 取梗死邊緣區(qū)組織50 mg在RIPA裂解液中充分裂解、勻漿，4℃離心取上清后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫封閉及一抗二抗孵育后曝光，最后對(duì)膠片進(jìn)行掃描后Quantity One圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度值分析，β-actin作為內(nèi)參。TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量利用TLR4、NF-κB條帶與β-actin的光密度值的比值表示。觀察給藥28天后各組心梗大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)及藥物影響。

1.5.5 ELISA檢測(cè)TNF-α、MCP-1、IL-6含量 ELISA法測(cè)定血清TNF-α、MCP-1、IL-6的變化，依據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。觀察給藥28天后各組心梗大鼠血清中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量變化及藥物影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左室功能比較

給藥28天后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠左室功能。模型組較假手術(shù)組：LVIDd、LVIDs均顯著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS均顯著降低(P<0.05)；給藥組較模型組：LVIDs顯著性降低(P<0.05)、LVEF、LVFS均顯著性升高(P<0.05)、LVIDd無(wú)明顯變化；益氣活血組與培哚普利組比較： LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS，各指標(biāo)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 給藥28天后各組心梗大鼠左心室功能變化

2.2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織HE染色結(jié)果

給藥28天后，梗死邊緣區(qū)HE染色發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組心肌纖維排列規(guī)整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，少見(jiàn)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；模型組心肌纖維排列散亂，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞形態(tài)明顯改變、呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，間隙明顯增寬，細(xì)胞核游移散亂，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；培哚普利組和益氣活血組心肌纖維排列較為規(guī)整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞間隙稍有增寬，可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

注：A:假手術(shù)組；B:模型組；C:培哚普利組；D:益氣活血藥組

2.3 各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)情況

給藥28天后，檢測(cè)各組梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：模型組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著性升高(P<0.05)；培哚普利組和益氣活血組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較模型組顯著性降低(P<0.05)；給藥組組間，TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果

注：A:假手術(shù)組; B:模型組; C:培哚普利組; D:益氣活血藥組

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量變化

給藥28天后，檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量，結(jié)果顯示：模型組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較假手術(shù)組顯著性升高(P<0.05)；培哚普利組和益氣活血藥組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較模型組顯著性降低(P<0.05)；在用藥組間，血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、MCP-1及IL-6含量變化

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為心主血脈，脈為血府，以氣為本。MI在中醫(yī)上屬于“胸痹”“真心痛”范疇，病機(jī)多屬“本虛標(biāo)實(shí)”，陽(yáng)虛、氣虛為本，血瘀為標(biāo)[8]。針對(duì)氣虛血瘀的病機(jī)，臨床上多采用益氣活血的組方進(jìn)行治療。本研究中益氣活血藥以黃芪、當(dāng)歸、生曬參、川芎、三七等藥進(jìn)行配伍組方，發(fā)揮益氣活血、通補(bǔ)兼施的功效，對(duì)MI氣虛血瘀證具有重要的應(yīng)用價(jià)值。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血藥通過(guò)調(diào)節(jié)MI后心室重構(gòu)、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡[9-11]對(duì)心室功能發(fā)揮保護(hù)作用。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)在多種疾病的進(jìn)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。作為經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)通路，在MI的相關(guān)研究中，TLR4/NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)介導(dǎo)心肌炎癥損傷和心肌重塑，這些炎癥因子包括TNF-α、MCP-1及IL-6等[12-14]。在對(duì)MI后心力衰竭的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，能夠改善心肌缺血后心室功能的進(jìn)展性障礙，降低心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。Yang等[17]利用分離出的紫草素作用心臟損傷模型，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)抑制膠原聚集、TLR4/NF-κB等途徑，顯著改善心肌損傷后的心功能，減少心肌纖維化、抑制炎癥、減輕細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解體內(nèi)心力衰竭。HU等[18]通過(guò)敲除小鼠TLR4基因研究高脂飲食所致的心功能不全，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在其中起重要作用，TLR4基因敲除可能通過(guò)NF-κB/JNK調(diào)節(jié)自噬，抑制炎癥和活性氧自由基，改善心肌收縮功能和Ca2+異常，減輕心肌重塑和收縮功能障礙的發(fā)生和發(fā)展。

本研究基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路，從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，研究益氣活血藥對(duì)MI后心室功能的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，益氣活血藥能夠顯著改善心梗大鼠左室功能，抑制TLR4、NF-κB蛋白在梗死邊緣區(qū)心肌組織中的表達(dá)，降低心梗大鼠血清組織中TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子的含量，減輕心梗大鼠MI后持續(xù)的炎癥反應(yīng)。提示益氣活血藥可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制心梗大鼠的炎癥反應(yīng)，阻止心室功能的進(jìn)展性障礙，從而發(fā)揮保護(hù)心梗大鼠心室功能的作用。

綜上所述，心室功能的進(jìn)展性障礙作為影響MI預(yù)后的重要因素，研究其病理基礎(chǔ)和藥物對(duì)其進(jìn)行防治的作用機(jī)制具有重要意義。益氣活血藥在阻止MI后心室功能的進(jìn)展性障礙方面能夠發(fā)揮重要的作用，TLR4/NF-κB信號(hào)通路作為潛在的作用途徑，可能通過(guò)抑制慢性炎癥反應(yīng)保護(hù)心臟功能。