張迪 晏軍 錢瑩 姚興偉 付躍峰 郭楠 劉清泉 孔令博

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是醫(yī)院環(huán)境中最主要的病原菌，PA引起的院內(nèi)肺炎占到院內(nèi)肺炎病例的18%以上，最新研究顯示，院內(nèi)肺炎的死亡率已經(jīng)到了13%～50%[1-2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種重要的晚期炎性介質(zhì)，受到PA刺激后，單核巨噬細(xì)胞將其分泌到細(xì)胞外環(huán)境發(fā)揮促炎作用。HMGB1通過促進(jìn)核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)核轉(zhuǎn)位釋放炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，炎癥細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的釋放，形成一個正反饋回路，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[3-5]。耐藥PA肺炎在感染途徑、發(fā)病特點和病機上與中醫(yī)學(xué)伏邪理論存在高度的一致性。扶正透邪方扶正以助透邪，透邪以助扶正，針對耐藥PA肺炎有益氣養(yǎng)血、透邪外出之功。前期研究證明扶正透邪方在早期可升高體內(nèi)白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平，刺激促炎因子釋放，幫助清除細(xì)菌和毒素[6]，但對后期的炎癥反應(yīng)研究不足。本實驗通過觀察扶正透邪方對耐藥PA肺炎HMGB1水平的影響，及NF-κB和IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步探討扶正透邪方對耐藥PA肺炎的作用機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，同時豐富伏邪理論的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

扶正透邪方組成：黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，以上藥物均為中藥全成分免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

1.2 實驗菌株

耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株，樣本號：20PXSP1925，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院細(xì)菌室進(jìn)行菌種鑒定與藥敏檢測。

1.3 試劑與儀器

HMGB-1(批號：SEA399Ra)、IL-6 ELISA(批號：SEA079Ra)檢測試劑盒，購自武漢云克隆科技股份有限公司；UltraPure Agarose(批號：16500100)、SuperScript III RT 逆轉(zhuǎn)錄kit(批號：11752050)、Sybr qpcr mix(批號：4472920)，均購自美國ABI-invitrogen；HMGB1抗體(批號：Ab79823)、NF-κB抗體(批號：Ab76311)，購自英國Abcam公司。酶標(biāo)儀Microplate reader，ELx808，美國Biotek；熒光定量PCR儀，StepOne Software，美國Applied biosystems；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)，Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply，美國BIO-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，GelDoc-It310，美國UVP；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，170-8280，美國BIO-Rad。

1.4 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠12只，雄性，體重(200±20) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SYXK(京)2020-0013。購入后置于微生物免疫動物室動物潔凈飼養(yǎng)。隨機分為空白組、模型組和扶正透邪組，共3組。每組各4只，各組按于7天后留取標(biāo)本。動物實驗經(jīng)北京盈科瑞生物醫(yī)藥研究所倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號IACUC-YKRSW-2021-D001)。

1.5 模型制備、藥物干預(yù)

1.5.1 模型制備 大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，待大鼠完全麻醉后，用皮筋將其固定于木板上，用鑷子輕輕拉出大鼠舌頭，打開照明燈對準(zhǔn)大鼠頸部，調(diào)整大鼠頭部位置，直到通過口腔可以看到聲門裂。用微量進(jìn)液器抽50 μL菌液，緩慢將微量進(jìn)液器針頭送入聲門裂，向氣管內(nèi)緩慢滴注菌液。滴注菌液后迅速將大鼠從鼠板上取下，雙手握住大鼠上肢，使大鼠直立，并左右搖擺，使菌液均勻分布于大鼠左右兩肺[7]?？瞻捉M按上述方法在大鼠氣管內(nèi)注入等量的無菌生理鹽水。造模過程中大鼠無死亡。

1.5.2 藥物干預(yù) 空白組予蒸餾水灌胃；模型組在感染后予蒸餾水灌胃；扶正透邪組在感染后予扶正透邪全方水煎劑灌胃，各組灌胃每日2次，每次2 mL。扶正透邪方組成：黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，根據(jù)Meeh-Rubner計算實驗動物的體表面積公式換算，每只大鼠使用藥物為黃芪1.15 g、當(dāng)歸0.3 g、金銀花0.3 g、青蒿0.2 g、虎杖0.2 g，相當(dāng)于臨床成人用量的0.019倍[8]。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

樣本制備：予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，麻醉后，常規(guī)消毒大鼠腹部皮膚，打開腹腔，分離腹主動脈，予一次性無菌采血針接5 mL空白采血管，進(jìn)行取血，并留取肺組織。采血完畢后，空白采血管室溫放置1小時，再4℃放置1小時，離心，2500 r/min，20分鐘，分離血清，分裝后-70℃保存。將肺組織切成小塊，放入離心管中，置于-70℃保存。

1.6.1 病理切片 將肺組織制作石蠟切片，切片厚度4 μm，蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書操作，檢測血清中HMGB1、IL-6的OD450吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)平濃度-吸光度值曲線折算出實際濃度。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測 取待檢測樣品，按照Trizol試劑盒說明書步驟提取總RNA，純化后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III說明書使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)體系進(jìn)行引物擴增。擴增完畢后，使用2-ΔΔCt法計算HMGB1、NF-κB mRNA的相對表達(dá)量。

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡法(western blot，WB)檢測 肺組織勻漿提取蛋白，稀釋后測定蛋白濃度上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。隨后將膜在室溫下封閉2小時，之后加入一抗抗體孵育1.5小時。一抗孵育完成后洗膜3次，再加入二抗抗體孵育2小時。最后將膜放至在顯影儀中避光顯影、拍照。

1.6.5 免疫組化檢測 將各組肺組織，以HMGB1、NF-κB一抗和山羊抗兔的二抗進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠HE結(jié)果

空白組支氣管壁光滑完整，上皮細(xì)胞排列整齊，少量炎癥細(xì)胞浸潤；模型組氣管壁充血水腫、管腔狹窄，肺泡腔縮小，大量炎癥細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落；扶正透邪組管壁較模型組光滑，氣管壁腫脹、管腔狹窄和炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量較模型組明顯減輕。見圖1。

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組

2.2 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

ELISA結(jié)果示：模型組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

2.3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達(dá)

模型組肺組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組HMGB1、NF-κB mRNA明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達(dá)

2.4 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

模型組肺組織中HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

圖2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

2.5 免疫組化

空白組HMGB1表達(dá)較弱，模型組HMGB1表達(dá)較強，扶正透邪組HMGB1表達(dá)較模型組減弱，深棕色為HMGB1表達(dá)陽性細(xì)胞，見圖3?？瞻捉MNF-κB表達(dá)較弱，模型組NF-κB表達(dá)較強，扶正透邪組NF-κB表達(dá)較模型組減弱，深棕色為NF-κB表達(dá)陽性細(xì)胞，見圖4。

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組(深棕色為HMGB1表達(dá)陽性細(xì)胞)

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組(深棕色為NF-κB表達(dá)陽性細(xì)胞)

3 討論

伏邪是指感受邪氣，即時不發(fā)，伏藏于體內(nèi)，逾時而發(fā)。研究伏邪理論發(fā)現(xiàn)耐藥菌感染在感染途徑、發(fā)病特點和病機上存在高度一致性[9]。伏邪的祛除強調(diào)“透邪”，透邪主要有兩層含義：一是要用透的方法給邪以出路，透達(dá)邪氣[10]；二是祛邪要除透、除盡，避免未除之邪繼續(xù)伏留體內(nèi)，耗傷正氣。在伏邪的治療上，扶正亦是關(guān)鍵。抗生素多屬寒涼，加之伏邪發(fā)病多有發(fā)熱，苦寒之藥的使用，都會損傷人體陽氣，因此在治療上溫陽助陽就顯得尤為重要。正如柳寶詒的《惜余醫(yī)案》所說：“若惟取其陰而不鼓動其陰中之陽,恐邪機仍冰伏不出。擬于大劑養(yǎng)陰托邪之中,佐以鼓蕩陽氣之意,俾邪機得以外達(dá)三陽為吉[11]。”因此伏邪的治療以扶正透邪為主，扶正以助透邪，透邪以助扶正。劉清泉教授經(jīng)過幾十年臨床實踐和對伏邪理論的深入研究，博采眾方，提出以扶正透邪方治療耐藥銅綠假單胞菌肺部感染，為臨床耐藥菌感染治療拓寬了思路[12]。方中以黃芪、當(dāng)歸、金銀花為主藥，黃芪健脾補中，升陽舉陷，其扶正助氣功效可使邪熱外透、托毒外達(dá)，因此劑量最大；金銀花散熱解毒，善于透血分熱邪于外轉(zhuǎn)入氣分；當(dāng)歸補血活血，兼能行血；青蒿清透虛熱、涼血除蒸，可治療病邪在氣分、血分之病，虎杖清熱化瘀。大劑量黃芪與當(dāng)歸相配，如《內(nèi)傷外辨惑論》的當(dāng)歸補血湯，是經(jīng)典的氣血雙補之方，方中重在黃芪大補肺脾以資氣血生化之源，配以當(dāng)歸以補氣生血，令血氣充盈，陰平陽秘，可針對熱病日久，耗氣及血而致氣虛血虧、氣滯血瘀之證，并可退虛熱；黃芪與金銀花相配為外科瘡瘍方中常用配伍，意在益氣和營清熱，兩藥相配性甘味稍涼，即免苦寒耗損氣陰，又可透邪外出。當(dāng)歸、金銀花取自四妙勇安湯，有通利血脈、活血補血、透邪外出之意。全方補而不膩，給邪以出路，從而達(dá)到益氣養(yǎng)血，透邪外出之功。

耐藥銅綠假單胞菌感染引起的炎癥反應(yīng)分為早期和晚期，早期反應(yīng)以促炎為主，主要促炎因子有TNF-α、IL-1β等。研究發(fā)現(xiàn)，扶正透邪方在早期可升高體內(nèi)IL-1β水平，刺激促炎因子釋放，幫助清除細(xì)菌和毒素[6]。但對晚期炎癥因子的研究較少，晚期如果炎癥得不到控制，啟動炎癥信號級聯(lián)傳遞，會導(dǎo)致病情加重，死亡率升高。HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白，在細(xì)胞內(nèi)、外微環(huán)境中起著不同的作用，是典型的炎性反應(yīng)晚期調(diào)節(jié)因子[13]。研究發(fā)現(xiàn)，PA感染的COPD患者HMGB1呈高表達(dá)水平，且隨感染加重肺功能損傷進(jìn)一步加重，血清中HMGB1水平也隨之增高[14]。升高的HMGB1可以和PA的膜成份LPS結(jié)合，同時作為轉(zhuǎn)移分子將二者復(fù)合物帶到CD14和TLR4，作用于TLR4下游信號通路，導(dǎo)致NF-κB激活，促進(jìn)TNF-α、IL-1β等炎癥基因轉(zhuǎn)錄，引起炎癥反應(yīng)[15- 16]。丁軍穎等[17]觀察PA肺炎大鼠免疫功能時發(fā)現(xiàn)PA肺炎大鼠HMGB1及效應(yīng)分子IL-1β、TNF-α均明顯升高，對PA感染大鼠使用HMGB1拮抗劑可明顯減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放[18]。HMGB1還可損害巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加感染PA小鼠的死亡率，GTS-21可以抑制HMGB1釋放從而增強巨噬細(xì)胞的功能，提高細(xì)菌清除率，減少肺損傷[19]。以上研究表明HMGB1在PA肺炎中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平均升高，同時伴有肺組織損傷，與以上結(jié)果相一致。在此基礎(chǔ)上，扶正透邪方可降低HMGB1基因和蛋白的表達(dá)，改善肺組織損傷情況，說明扶正透邪方可減輕PA感染晚期炎癥反應(yīng)，保護肺組織。

NF-κB是目前研究最多的炎癥相關(guān)通路之一，NF-κB信號通路活化與機體炎癥因子分泌密切相關(guān)。研究表明，給予肺上皮細(xì)胞銅綠假單胞菌LPS處理后，可以明顯活化NF-κB信號通路，表明NF-κB是引起機體炎癥反應(yīng)的重要原因[20]。HMGB1分泌到細(xì)胞外環(huán)境中后可結(jié)合多種受體激活NF-κB信號通路，如HMGB1與RAGE結(jié)合后，引發(fā)Ras、PI3K和Rho的激活，并成為下游NF-κB激活的主要信號分子[21]。HMGB1也可與TLR4結(jié)合，激活NF-κB，引起下游的炎癥介質(zhì)釋放[22-23]。HMGB1也可與TLR9相互作用，通過與TLR9結(jié)合引導(dǎo)MyD88和NF-κB的下游途徑發(fā)出信號，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放[24]。因此，HMGB1可以通過與多種受體結(jié)合激活NF-κB，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄促炎基因，如IL-1、IL-6和TNF-α等，發(fā)揮促炎作用[25]。IL-6在感染性病變中產(chǎn)生，并向全身發(fā)出警告信號。HMGB1被PRR識別后刺激包括NF-kB在內(nèi)的一系列信號通路，并增強IL-6等炎性細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄[26]。使用HMGB1抑制劑甘草酸，或使用HMGB1小干擾RNA(siRNA)可以有效地抑制HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-kB途徑[27-30]。雖然關(guān)于PA肺炎與HMGB1的研究很少，但在PA感染角膜炎的小鼠中使用siRNA沉默HMGB1后，可以降低NF-κB及下游炎癥因子的表達(dá)[31]，說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是PA肺炎后期炎癥反應(yīng)的重要通路。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比較，模型組HMGB1、NF-κB的基因和蛋白表達(dá)量均升高，同時IL-6水平也升高，說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是大鼠晚期炎癥反應(yīng)的通路之一。扶正透邪方可以降低PA肺炎大鼠HMGB1、NF-κB基因和蛋白表達(dá)，同時降低IL-6水平，在炎癥的晚期發(fā)揮作用。

本研究從動物實驗出發(fā)，探討了扶正透邪方對耐藥PA肺炎大鼠晚期炎癥反應(yīng)的影響，表明扶正透邪方可以減少PA肺炎晚期炎癥因子的釋放，保護肺組織。由于HMGB1的受體較多，因此對于HMGB1作用于NF-κB及NF-κB后續(xù)調(diào)控IL-6釋放等過程研究不足，有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，扶正透邪方可以減少HMGB1釋放來抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制IL-6的釋放，可能通過HMGB1/NF-κB/IL-6通路起到控制晚期炎癥反應(yīng)水平，保護肺組織的作用。提示扶正透邪方可以有效調(diào)節(jié)機體的晚期炎性免疫應(yīng)答，進(jìn)一步闡釋了扶正透邪方作用機制，豐富了伏邪理論，但具體反饋調(diào)節(jié)機制有待進(jìn)一步的研究揭示。