趙崇軍 李二文 李芝奇 范琦琦 魏靜 趙霞 林瑞超

芫花(FlosGenkwa)為瑞香科植物芫花的干燥花蕾，廣泛分布于中國長江流域各省和黃河流域的部分地區(qū)，具有瀉水逐飲、殺蟲療瘡的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芫花具有鎮(zhèn)痛抗炎[2-3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]等諸多藥理作用，但毒性限制了其臨床應(yīng)用。現(xiàn)有研究表明芫花對多個臟器存在毒性作用，向麗華等[6]研究24種中藥的長期毒性，表明芫花對肝臟、肺、腎臟、卵巢等七個臟器存在毒性作用；趙一等[7]研究表明芫花對家兔具有顯著的皮內(nèi)刺激性和眼結(jié)膜刺激作用?？梢娷净ǖ亩拘栽絹碓绞苤匾?。肝臟是藥源性損傷的主要靶器官之一，而中藥是引起慢性藥物肝損傷的重要原因之一[8]，目前基于傳統(tǒng)用藥方式對芫花水提物的肝損傷研究尚且有限。本實驗室前期工作中基于斑馬魚模型已完成多種有毒中藥的評價，并且通過評價斑馬魚肝臟表型、肝面積、部分酶活性等指標(biāo)，已確定芫花水提物會誘導(dǎo)斑馬魚幼魚肝臟腫大、出血、肝細(xì)胞凋亡等[9]，但其對斑馬魚肝臟的毒性具體機制尚不明確，本研究基于斑馬魚模型對芫花水提物的肝毒性機制進行深入探討，以期對芫花的臨床應(yīng)用和推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)；BX51熒光顯微鏡(日本奧林巴斯集團)；200 μL、1 mL、5 mL移液器(德國Eppendorf公司)；LRH-250Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；RJLDL-50G型離心機(無錫瑞江分析儀器有限公司)；HZQ-QX型全溫振蕩箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環(huán)?？萍加邢薰?；Epoch2微孔板分光光度計酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)。Nanodrop 2000凝膠電泳結(jié)合紫外分光光度(美國賽默飛世爾科技公司)；QuantStudio 3熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

Caspase-3活性檢測試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號G015)，TransZol Up Plus RNA Kit (北京天根生化科技有限公司，批號ER501)，F(xiàn)astKing cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號KR116)，RNA保護液(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號r1100)，4%多聚甲醛(北京生物科技有限公司，批號p1110)，油紅O染料(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號s19039-100g)，丙二醇(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號0575-4l)，丙三醇(北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司，批號1198677873)，甲酰胺(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號v900064-500 mL)，20×SSC緩沖液(pH=7.0，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號r21057-100 mL)，蘇木素—伊紅染液(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號d006)。芫花由安國圣山藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為瑞香科植物芫花的干燥花蕾，且符合藥典規(guī)定。

斑馬魚親本購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，實驗用野生AB系斑馬魚由本實驗室斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)繁育。

1.2 芫花樣品的制備

芫花水提物的制備：稱取50 g芫花置平底燒瓶中，加10倍量水回流提取2小時，過濾，再加10倍量水提取兩次，每次1小時。合并提取液，抽濾，濃縮，真空干燥，得芫花水提物16.59 g，得率為33.19%。

芫花水提物貯備液的配制：精密稱取研磨后的芫花水提物粉末0.1 g，置于50 mL離心管中，精密加入50 mL斑馬魚胚胎培養(yǎng)水，超聲60分鐘，配置成2000 mg/L的貯備液，分裝，置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

芫花樣品暴露給藥溶液的配制：用胚胎培養(yǎng)水將貯備液稀釋至所需濃度即可。

1.3 斑馬魚幼魚的養(yǎng)殖與選取

斑馬魚的養(yǎng)殖：斑馬魚的養(yǎng)殖和繁育參照Zebrafish Book[10]。實驗操作遵循經(jīng)濟合作與發(fā)展組織標(biāo)準(zhǔn)。斑馬魚保持在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫(28±1)℃，pH值7.0～7.2，電導(dǎo)率450～550 μs/cm，光照/黑暗周期為14小時/10小時。成年斑馬魚每日喂食3次豐年蝦幼蟲。斑馬魚胚胎通過自然成對交配產(chǎn)生。選取成年斑馬魚雌雄(1∶1)放入帶隔板的產(chǎn)卵缸，次日早晨給予光照抽取隔板完成交配。將魚卵收集于無菌培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下去除死的和未受精的胚胎，并用培養(yǎng)液清洗，加培養(yǎng)液置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，每24小時更換一次培養(yǎng)液。斑馬魚胚胎培養(yǎng)水的配置：按照Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制[10]，0.137 mol/L的NaCl、5.4 mol/L的KCl、0.25 mol/L的Na2HPO4、0.44 mol/L的K2HPO4、1.3 mol/L的CaCl2、1.0 mol/L的MgSO4、4.2 mol/L的NaHCO3水溶液。

斑馬魚的選?。哼x取發(fā)育正常、無畸形的4 dpf AB系野生斑馬魚幼魚，隨機放于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔20條，加入適量等體積的胚胎培養(yǎng)水。

1.4 斑馬魚幼魚的藥物暴露處理

根據(jù)前期實驗結(jié)果，選擇200 mg/L、150 mg/L、100 mg/L濃度的藥液對斑馬魚進行暴露處理，每組尾數(shù)為20(實驗重復(fù)3次)。按照“1.2”藥液的配制原則，將貯備液稀釋成不同濃度的藥液。將裝有幼魚的12孔板中的培養(yǎng)水依次吸出，并快速加入4 mL不同濃度的藥液，孔板中的最終暴露濃度為高濃度組200 mg/L、中濃度組150 mg/L、低濃度組100 mg/L，空白對照組為等體積新鮮胚胎水。每個濃度含有2個復(fù)孔。加蓋標(biāo)記后，將孔板置于可控溫光照培養(yǎng)箱中(28.5℃)24小時(黑暗與光照時間比為5∶7)，實驗終點即完成藥物暴露。

1.5 斑馬魚幼魚肝臟病理組織狀態(tài)的分析

為了觀察斑馬魚經(jīng)藥物處理后肝臟組織的病理學(xué)形態(tài)，對其做石蠟切片以進行觀察。按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養(yǎng)水清洗3次，轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度20條幼魚，PBS清洗3次，移除PBS，將收集好的魚體固定于4%的多聚甲醛緩沖液中12小時，流水沖洗4小時。然后進行脫水、透明處理，石蠟包埋，切成6 μm的薄片，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法，處理溫度為室溫。最后置于顯微鏡下觀察[11]。

1.6 斑馬魚幼魚肝臟脂肪堆積狀態(tài)的觀察

按照上述“1.4”的方法進行藥物暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養(yǎng)水清洗3次，轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，移除PBS，將收集好的魚體固定在4%的多聚甲醛中，4℃條件下過夜。固定之后，將幼魚轉(zhuǎn)移到12孔板中，使用1×PBS沖洗后，使用混合溶液進行漂白：6 mL無菌水、30%的雙氧水3.3 mL、0.5 mL甲酰胺、20×SSC的緩沖液0.25 mL。使用1×PBS沖洗后，依次使用85%和100%的丙二醇進行滲透，每次10分鐘，隨后浸沒在0.5%油紅O中，在黑暗的條件下過夜染色。隨后依次使用100%和85%丙二醇進行沖洗，脫色，每次30分鐘。隨后用1×PBS進行沖洗，保存在80%丙三醇中[12]，置于顯微鏡下觀察拍照，觀察是否有脂肪的堆積。所有油紅染色操作都需要在常溫下的緩慢振蕩器中進行。

1.7 斑馬魚幼魚基因表達(dá)的分析

按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用胚胎培養(yǎng)水清洗3次，轉(zhuǎn)入含有1 mL RNA保護液的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，在-80℃下貯存至測定。使用TransZol Up Plus RNA Kit提取總RNA。通過凝膠電泳和UV分光光度計驗證RNA樣品的完整性。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將來自不同組的等量總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用CFX96 Touch Systems和TransStart Top Green qPCR Super Mix進行定量實時PCR分析。所有過程均根據(jù)不同套件提供的制造商說明進行。用于PCR的斑馬魚特異性引物使用Primer Premier 5.0軟件(表1)設(shè)計并由生物醫(yī)學(xué)(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)生產(chǎn)。兩步PCR擴增方案如下：95℃ 3分鐘、95℃ 30秒、60℃ 60秒，然后40個循環(huán)。

表1 引物序列

1.8 斑馬魚幼魚Caspase-3活性檢測

按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養(yǎng)水清洗3次，轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，PBS清洗3次，移除PBS，迅速稱重并將樣本保存于-80 ℃，按照每50 mg樣本組織加入50 μL裂解工作液將斑馬魚組織樣本裂解勻漿，4℃、12000 r/min離心5分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，立即測定Caspase-3的酶活性，同時取少量樣本用Bradford法測定蛋白濃度。Caspase-3酶活性的測定步驟按照試劑盒操作說明進行，最后用酶標(biāo)儀測定405 nm處的吸光值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚幼魚肝臟組織病理學(xué)的改變

實驗結(jié)果顯示，空白對照組肝臟區(qū)域的細(xì)胞完整，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核成規(guī)則圓形；高濃度組中，肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，肝實質(zhì)細(xì)胞減少，出現(xiàn)萎縮變形，部分區(qū)域可見胞質(zhì)溶解造成空泡化，排列松散，肝臟區(qū)域部分界線模糊。如圖1所示。

注：A：空白對照組×100；B：空白對照組×400;C：高濃度組×100；D:高濃度組×400

實驗結(jié)果顯示，空白對照組斑馬魚肝臟部分未被著色，高濃度組斑馬魚肝臟區(qū)域呈現(xiàn)紅色。如圖2所示。

注：A：空白對照組；B：高濃度組。

2.2 斑馬魚幼魚基因表達(dá)的改變

實驗結(jié)果顯示，相對于空白對照組，給藥組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因包括激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，atf4a)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、90KDA熱休克蛋白Β，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心信號1(endoplasmic reticulum to nucleus signalling 1，ern1)、熱休克蛋白70成員5[heat shock protein family A (Hsp70) member 5，hspa5]、真核翻譯起始因子2A激酶3(recombinant eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 3，eif2ak3)、EIF2S1蛋白磷酸化抗體對(protein phosphorylation antibody pair，eif2s1)的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)；三羧酸循環(huán)相關(guān)基因丙酮酸脫氫酶E1α亞單位基因(pyruvate dehydrogenase E1 α-subunit A，pdha1a)和糖酵解相關(guān)基因肝紅細(xì)胞丙酮酸激酶(recombinant human pyruvate kinase, Liver And RBC，pklr)在給藥組中表達(dá)下調(diào)；肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因肝型—脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-fatty acid binding protein，L-FABP)的mRNA表達(dá)水平上調(diào)；瘦素受體(leptin receptor，Lepr)和視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)；解偶聯(lián)蛋白2(uncouplingprotein 2，ucp2)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，sod1)基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào)；炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)上調(diào)；自噬相關(guān)基因自噬基因(beclin)、自噬相關(guān)蛋白3(autophagy related 3 homolog，ATG3)下調(diào)；B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族成員中抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，促進細(xì)胞凋亡的Bid基因表達(dá)上調(diào)。實驗結(jié)果如表2所示。

表2 不同濃度芫花水提物對斑馬魚幼魚基因相對表達(dá)量的影響

2.3 斑馬魚幼魚Caspase-3活性檢測

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，芫花水提物高濃度組的斑馬魚幼魚Caspase-3活性升高，并具有顯著性差異(P<0.05)。如表3所示。

表3 不同濃度芫花水提物對斑馬魚幼魚

3 討論

國際上常規(guī)的毒理學(xué)研究終點均因傳統(tǒng)評價模型的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性較差而無法成為肝毒性早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)。而本實驗采用斑馬魚為模型，斑馬魚作為新興的藥物安全性評價的模式生物，介于體外細(xì)胞等實驗和體內(nèi)整體動物實驗之間，既具有細(xì)胞等體外實驗用藥量少、實驗費用低、周期短、高通量等特點，又具備整體動物實驗可觀察多個器官、可評價藥效學(xué)及藥動學(xué)、可評價代謝物活性等優(yōu)勢，其繁殖快、易飼養(yǎng)、胚胎及幼魚透明且便于觀察等優(yōu)勢也不可忽視[13]，非常適合在藥物開發(fā)的早期階段預(yù)測藥物的肝毒性，并且斑馬魚與人類基因組的相似度高達(dá)87%，有與人類近似的毒性特征和信號傳導(dǎo)通路，對外源化學(xué)物質(zhì)的防御機制與哺乳動物相當(dāng)，包括酶的誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激[14]。

實驗室前期工作探究芫花提取物的毒性作用，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)從斑馬魚幼魚的表型、生化指標(biāo)等的變化證明芫花對斑馬魚造成肝臟損傷，再從其生化指標(biāo)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶推測其可能是通過破壞機體的氧化應(yīng)激平衡造成肝損傷[9]，但具體的損傷程度及機制尚不明確，本研究緊接著對芫花肝臟毒性機制做進一步探討。通過病理切片和脂肪堆積狀態(tài)的結(jié)果可以看出，芫花對斑馬魚肝臟的毒性作用表現(xiàn)在肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，部分區(qū)域嚴(yán)重空泡變性，排列松散；肝臟及卵黃囊處有脂肪堆積。為了明確這一病理變化，本課題組研究了芫花水提物對斑馬魚幼魚的潛在毒性機制，結(jié)果表明，其潛在機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激，先天免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場所，其對蛋白質(zhì)的合成、折疊以及轉(zhuǎn)運等過程發(fā)揮重要作用。但一些病理因素可能會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)，甚至是造成細(xì)胞的凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)主要激活3條細(xì)胞信號通路：未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超載反應(yīng)(endoplasmic reticulum-overload response，EOR)及固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)。其中，URP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中最重要的信號通路[15]。ERS和URP相關(guān)的基因包括atf4a, hsp90b1, eif2s1，在芫花水提物的誘導(dǎo)下，這些基因在斑馬魚中顯著上調(diào)。而且，有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[16]，表明斑馬魚幼魚脂肪堆積也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。L-FABP在肝細(xì)胞中可大量表達(dá)，其主要功能包括脂肪酸的轉(zhuǎn)運、核信號傳導(dǎo)及脂代謝作用[17]，給藥組中L-FABP表達(dá)上調(diào)，可能是由于斑馬魚脂質(zhì)堆積增強了L-FABP的表達(dá)。Rbp4是一種脂肪細(xì)胞分泌因子，它在人類肝臟組織中表達(dá)最高，并且肥胖患者體內(nèi)，Rbp4表達(dá)是升高的[18]。因此，L-FABP和rbp4的表達(dá)上調(diào)也說明斑馬魚體內(nèi)有脂質(zhì)堆積。

線粒體的主要功能包括調(diào)節(jié)氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成、Ca2+穩(wěn)態(tài)等，并且參與多種重要營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[19]。三羧酸循環(huán)是在線粒體中進行的，本研究結(jié)果表明其相關(guān)基因pdha1a在芫花水提物誘導(dǎo)的斑馬魚肝臟中下調(diào)，表明三羧酸循環(huán)受阻，即線粒體功能可能受損。糖酵解途徑是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨ATP生成的一系列途徑，產(chǎn)生的丙酮酸將進入線粒體繼續(xù)氧化分解，通過三羧酸循環(huán)及電子傳遞鏈徹底氧化成二氧化碳和水，并生成ATP。因此糖酵解會影響線粒體產(chǎn)生能量，其相關(guān)基因pklr表達(dá)水平的下調(diào)說明糖酵解受到抑制，影響線粒體產(chǎn)能。Ucp-2是線粒體膜內(nèi)陰離子載體超家族的成員。它通過一種不完全明確的機制調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和活性氧的生成，以減少線粒體電子傳輸過程中ROS的生成[20]。超氧化物歧化酶具有特殊的生理活性，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，是氧自由基的自然天敵。本研究結(jié)果顯示芫花水提物誘導(dǎo)ucp2和sod1基因表達(dá)的下降，ROS增多，導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)的氧化和抗氧化作用失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激的損傷下，對免疫應(yīng)答相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因進行研究，發(fā)現(xiàn)IL-1β、TNF-α表達(dá)在給藥斑馬魚組中上調(diào)，Beclin和ATG3則下調(diào)。IL-1β和TNF-α分別作為白介素IL-1家族中的促炎活性因子和參與全身性炎癥的腫瘤壞死因子，其表達(dá)水平的上調(diào)與肝臟損傷密切相關(guān)。Bcl-2定位于自由基生成的位點，作為抗氧化應(yīng)激的明顯抗氧化劑，可以防止細(xì)胞凋亡[21]；Caspase-3是最為關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡過程中起著不可替代的作用[22]。Bcl-2基因表達(dá)水平的下調(diào)，促進細(xì)胞凋亡的Bid基因表達(dá)上調(diào)及Caspase-3活性的升高均說明芫花水提物誘導(dǎo)斑馬魚幼魚的肝臟細(xì)胞凋亡。

綜合實驗結(jié)果，芫花水提物誘導(dǎo)斑馬魚幼魚的肝損傷，造成肝臟代謝功能異常，導(dǎo)致脂肪堆積?；蚪Y(jié)果顯示其可能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，破壞線粒體功能，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及產(chǎn)生炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果更加清楚地了解了芫花在斑馬魚幼魚中的毒性作用及潛在機制，為后續(xù)的研究工作及芫花的臨床應(yīng)用推廣提供一定的參考依據(jù)。