張 茜， 張 丹， 周 楠， 賴曉蕊， 徐境一， 李嘉寶， 王 鑫， 楊 蕾

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 營(yíng)養(yǎng)科，遼寧 沈陽 110016

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的增殖與凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心血管疾病中起關(guān)鍵作用，血管重塑是其最主要的機(jī)制之一，主要來源于血管損傷后VSMC的增殖和凋亡水平異常[1]。細(xì)胞增殖和凋亡涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。有研究報(bào)道，鞘磷脂在心肌梗死、高血壓、中風(fēng)、2型糖尿病和肥胖癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[2-3]。鞘磷脂是細(xì)胞膜的生物活性成分，也是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，參與細(xì)胞增殖、成熟和凋亡等多個(gè)過程。常見的鞘磷脂家族包括神經(jīng)酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)，均已經(jīng)被證明在細(xì)胞中發(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)作用[4]。近年來，神經(jīng)酰胺和S1P已成為許多研究的靶點(diǎn)。S1P是一種神經(jīng)酰胺衍生物，具有抗炎和促有絲分裂的功能，在心臟保護(hù)中起重要作用。S1P調(diào)節(jié)多種生理過程，包括免疫監(jiān)視、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、血管發(fā)育、細(xì)胞存活、血管生成、細(xì)胞分化和胚胎神經(jīng)發(fā)生，并被證明參與類固醇合成的調(diào)節(jié)[5]。S1P是控制細(xì)胞存活、炎癥和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。在血液中觀察到高水平的S1P，特別是在高密度脂蛋白和紅細(xì)胞中[6]。在心血管系統(tǒng)內(nèi)，S1P介導(dǎo)各種活動(dòng)，包括缺血/再灌注損傷后的心肌保護(hù)、改善內(nèi)皮功能、緩解氧化應(yīng)激和抗血栓[7]?；颊邅碓吹膬?nèi)皮細(xì)胞在后肢缺血的小鼠模型中顯示新生血管能力顯著受損，在靜脈輸注前用S1P預(yù)處理2 h后，患者來源的內(nèi)皮細(xì)胞顯著促進(jìn)了缺血后肢的血流恢復(fù)[8]。但關(guān)于S1P對(duì)VSMC的作用機(jī)制尚未闡明。本研究初步檢測(cè)了大鼠VSMCS1P受體的表達(dá)情況，并探討了S1P對(duì)大鼠VSMC增殖和凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠10只，體質(zhì)量120～160 g，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物中心提供。青霉素-鏈霉素購(gòu)自Solarbio公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自康寧公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol裂解液購(gòu)自日本Takara公司；所有一抗均購(gòu)自Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司；S1P購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠VSMC分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，無菌條件下打開胸腔，分離胸腹主動(dòng)脈并放入盛有無菌PBS的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕剝離血管外結(jié)締組織，放入另一盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中。用眼科剪沿縱軸剪開血管條，無菌鑷輕輕刮除內(nèi)膜，放入含20% FBS的高糖培養(yǎng)基中。用眼科剪剪碎血管條，使組織塊大小約1 mm×1 mm×1 mm，用無菌滴管將組織塊吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使其均勻貼壁，間距0.2～0.5 cm。向瓶?jī)?nèi)注入適量培養(yǎng)液，于37℃孵箱內(nèi)直立放置4～5 h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，此后每3 d換液1次，生長(zhǎng)至3～8代用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 大鼠VSMC鑒定 在24孔板中鋪片，接種大鼠VSMC，待細(xì)胞融合度約為60%～70%時(shí)棄去培養(yǎng)基，PBS清洗玻片，4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100破膜，5% BSA封閉，加入工作濃度的抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體，孵育過夜；PBS洗3次，加入工作濃度的熒光二抗，室溫避光孵育45 min，PBS沖洗后染DAPI，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 大鼠VSMC以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。細(xì)胞分組：對(duì)照組、S1P 20 nmol/L組、S1P 100 nmol/L組、S1P 500 nmol/L組、S1P 2 500 nmol/L組及S1P 12 500 nmol/L組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)各組加入S1P培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以400 μM濃度的H2O2誘導(dǎo)凋亡。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定細(xì)胞活性 將細(xì)胞以1×103個(gè)/cm2的密度接種于96孔板中，邊緣孔用無菌的PBS填充，每孔加入20 μl四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，待結(jié)晶充分溶解后，用微板分光光度計(jì)測(cè)定490 nm處的光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5 原位末端標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后0.3% Triton X-100室溫孵育5 min；按照TdT酶：熒光標(biāo)記液以5∶45的比例配制原位末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)檢測(cè)液，PBS洗滌后加檢測(cè)液，避光孵育1 h；PBS洗3次，DAPI孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核，PBS清洗后使用防猝滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.6 Western blot 細(xì)胞離心后加入裂解液，冰上裂解后再次離心，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)樣本濃度加入Loading buffer制備蛋白樣本，進(jìn)行蛋白電泳。一抗?jié)舛确謩e為Bax抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶1 000)、cleave-caspase-3 抗體(1∶500)、cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。PBST洗膜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育60 min，滴加電化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Tanon凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白表達(dá)信號(hào)，并用ImageJ軟件分析蛋白條帶強(qiáng)度。

1.2.7 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)按照TRIzol試劑說明書的步驟進(jìn)行，引物序列如下：S1P受體(S1P receptor，S1PR)1，F(xiàn)：AACTTTGCGAGTGAGCTGGT，R：CTAGAGGGCGAGGTTGAGTG；S1PR2，F(xiàn)：ATAGACCGAGCACAGCCAAC，R：GAGGTGGTCTCCTGCATGTC；S1PR3，F(xiàn)：AAGCCTAGCGGGAGAGAAAC，R：TCAGGGAACAATTGGGAGAG；S1PR4，F(xiàn)：GGACTTCTCGGTCACTCAGC，R：GGCTTGCTGTCATGTTCTCA；S1PR5，F(xiàn)：GGAGGGACTCTCCTGGATTC，R：TTCCTCTGTAGCCAGCCACT。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，檢測(cè)大鼠VSMC中S1P受體的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞鑒定 大鼠VSMC的主要分子標(biāo)志為α-SMA，利用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)大鼠VSMC中α-SMA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，提取的原代大鼠平滑肌細(xì)胞上α-SMA蛋白呈高表達(dá)。見圖1。

圖1 大鼠VSMC免疫熒光化染色結(jié)果(a.α-SMA抗體染色；b.DAPI)

2.2 MTT檢測(cè)S1P對(duì)大鼠VSMC增殖的影響 不同濃度的S1P處理組與對(duì)照組比較，S1P濃度<500 nmol/L對(duì)細(xì)胞的增殖活性無明顯的抑制作用，反而有一些促進(jìn)作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在S1P 500 nmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性達(dá)到最高，而S1P濃度在2 500 nmol/L和 12 500 nmol/L對(duì)細(xì)胞的增殖活性存在一定的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，本研究采用的S1P濃度為 500 nmol/L，后續(xù)研究不會(huì)受到 S1P濃度的影響。見圖2。

圖2 MTT法檢測(cè)加藥S1P對(duì)大鼠VSMC增殖的影響

2.3 S1P受體的表達(dá)情況 S1P按500 nmol/L濃度加藥處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測(cè)S1P受體基因的表達(dá)情況。大鼠VSMC主要表達(dá)受體S1PR1、S1PR2、SIPR3，而S1PR4和S1PR5表達(dá)量很低。S1PR2的基因表達(dá)量最高，而S1PR1基因表達(dá)量相對(duì)較少。見圖3。

圖3 RT-PCR檢測(cè)大鼠VSMC受體表達(dá)情況

2.4 TUNEL染色檢測(cè)S1P對(duì)大鼠VSMC凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，400 μM的H2O2溶液能明顯誘導(dǎo)VSMC凋亡。與H2O2處理組比較，在H2O2+S1P處理組中，TUNEL染色陽性率明顯下降，提示S1P可減弱大鼠VSMC中凋亡水平。見圖4。

圖4 TUNEL檢測(cè)S1P對(duì)大鼠VSMC凋亡的影響(a.H2O2處理組;b.H2O2+S1P處理組)

2.5 Western blot檢測(cè)S1P對(duì)大鼠VSMC增殖及凋亡水平的影響 以PCNA蛋白表達(dá)情況觀察S1P對(duì)大鼠VSMC增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S1P處理后PCNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示S1P可提高大鼠VSMC的增殖能力。見圖5。以Bax及Bcl-2蛋白比值和cleave-caspase-3及總caspase-3蛋白比值的變化觀察S1P對(duì)大鼠VSMC凋亡水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，S1P處理后的大鼠VSMC中Bax與Bcl-2的比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；cleave-caspase-3與caspase-3總蛋白的比值也顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示S1P可抑制大鼠VSMC的凋亡水平。見圖6。

圖5 Western blot檢測(cè)加藥S1P對(duì)大鼠VSMC增殖的影響

圖6 Western blot檢測(cè)加藥S1P對(duì)大鼠VSMC凋亡的影響

3 討論

由高血壓、高血糖和高脂血癥引起的心血管疾病是全球死亡的主要原因之一。VSMC不僅是血管的主要組成成分，也是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要細(xì)胞成分[9]，受血流施加的恒定機(jī)械應(yīng)力的影響。因此，VSMC的增殖、凋亡、遷移、炎癥、分化和表型改變與血管重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)[10]。然而，引起VSMC病理生理表現(xiàn)的機(jī)械力的潛在機(jī)制仍不清楚。

鞘磷脂代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺、S1P和神經(jīng)酰胺磷酸鹽是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生或免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)汝P(guān)鍵生理功能的主要信號(hào)分子，并參與多種病理過程。S1P是一種有生物活性的鞘磷脂，在不同的器官系統(tǒng)中調(diào)節(jié)著不同的生理功能。S1P具有5種特異性的細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體(S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5)，在心血管系統(tǒng)中的作用多種多樣，這取決于其產(chǎn)生的細(xì)胞類型。S1P對(duì)單核細(xì)胞的粘附和遷移以及平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力有不同的影響，這對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展至關(guān)重要[11]。S1P、S1P受體、Src激酶、CXCR4受體介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢和功能整合到缺血組織是必不可少的[12]。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720的S1P受體激動(dòng)劑促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1誘導(dǎo)的人CD34+祖細(xì)胞遷移和骨髓歸巢。有研究報(bào)道，S1P通過rac1和Cdc42信號(hào)通路恢復(fù)骨髓來源的祖細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障保護(hù)功能[14]。此外，S1P可抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和隨后的遷移，以及內(nèi)皮細(xì)胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。S1P通過S1PR3/PDGFR-β/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和血管生成[12]。

VSMC是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞，心血管疾病(包括高血壓、動(dòng)脈硬化和血管狹窄)與VSMC功能障礙密切相關(guān)[15-16]。本研究結(jié)果表明，一定濃度的S1P可使VSMC PCNA蛋白表達(dá)水平升高，Bax/Bcl-2水平下降。PCNA是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)DNA損傷耐受，減少細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡，Bcl-2蛋白為抗凋亡標(biāo)志物，Bax為促凋亡標(biāo)志物，Bcl-2/Bax平衡失調(diào)可誘導(dǎo)VSMC發(fā)生凋亡，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。VSMC增殖和凋亡是心血管發(fā)生病變的主要病理基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，適量S1P可促進(jìn)大鼠VSMC增殖，抑制凋亡發(fā)生，為 S1P可作為干預(yù)靶點(diǎn)治療以 VSMC為發(fā)病核心環(huán)節(jié)的心血管疾病提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但由于S1P具有5種特異性細(xì)胞表面受體，了解具體哪種受體在改善VSMC的生物學(xué)特性中起重要作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，S1P信號(hào)是眾多促血管生長(zhǎng)因子的一種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可被看作是一種脂類促血管生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮重要作用。一定濃度的S1P可使VSMC增殖水平升高，凋亡水平下降。