趙曉杰， 布雨鑫， 閆承慧， 劉 丹

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

TRIM55是近年發(fā)現(xiàn)的橫紋肌特異性泛素連接酶[1-2]。人TRIM55基因定位在8號染色體上，共含10個外顯子，可編碼548個氨基酸[3]。TRIM55主要表達(dá)于骨骼肌和心臟[4-5]，在心肌和骨骼肌的肌節(jié)組裝、肌肉結(jié)構(gòu)和功能的維持中發(fā)揮重要作用，還可以調(diào)控骨骼肌細(xì)胞分化、影響心肌細(xì)胞線粒體自噬[6-7]。此外，TRIM55點突變與肥厚型心肌病的發(fā)病、臨床癥狀密切相關(guān)，其多態(tài)性位點還與心力衰竭發(fā)病有關(guān)[8-9]。本研究旨在建立及鑒定TRIM55基因敲除小鼠，為深入闡明TRIM55在心臟和骨骼肌中的作用及機(jī)制提供新的工具?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIM55抗體(英國Abcam)；β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；HRP標(biāo)記的二抗(美國Jackson Immuno Research)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA)；蛋白裂解液RIPA(美國Thermofisher Scientific)；引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.2 實驗動物及配繁方案 3只雄性TRIM55雜合子小鼠和10只雌性C57BL/6J小鼠均購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。首先，將雄性TRIM55雜合子小鼠與雌性C57BL/6J小鼠進(jìn)行交配，獲得雌性TRIM55雜合子小鼠；再將雄性TRIM55雜合子小鼠與雌性TRIM55雜合子小鼠進(jìn)行交配，以獲得TRIM55基因敲除小鼠。

1.3 基因型鑒定 子代小鼠滿4周時分籠并打耳釘進(jìn)行編號。提取鼠耳基因組DNA，具體方法如下：將小鼠耳放于裂解液中(含蛋白酶K)，55℃水浴鍋2 h，95℃水浴鍋5 min終止消化，13 000 r/min離心5 min，上清即為提取的DNA。然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，引物見表1。反應(yīng)體系：gDNA Template2 μl，10×Taq master mix10 μl，Primer mix(10 M)1 μl，H2O補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：(1)95℃ 5 min；(2)95℃ 30 s；(3)58℃ 30 s；(4)72℃30 s；(2)～(4)共40個循環(huán)；(5)72℃3 min；(6)25℃保持。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳及基因型鑒定。

表1 TRIM55基因敲除小鼠基因型鑒定引物

1.4 熒光定量PCR檢測TRIM55基因表達(dá) 選取8周齡雄性TRIM55基因敲除小鼠及野生型小鼠各3只，處死后分離各組小鼠心臟組織和骨骼肌組織，采用Trizol法提取心臟組織和骨骼肌組織的總RNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。TRIM55正向引物AAAGCAACTGATCTGTCCCATC，反向引物TGTGGGTAAGTACGGGTTAGAG；GAPDH正向引物AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，反向引物GGGGTCGTTGATGGCAACA。相對表達(dá)量用2-△△CT表示。

1.5 Western Blot檢測TRIM55蛋白表達(dá) 選取8周齡雄性TRIM55基因敲除小鼠及野生型小鼠各3只，處死后取20 mg心肌組織和20 mg骨骼肌，加入200 μl蛋白裂解液對組織進(jìn)行裂解，4℃放置30 min，13 000 r/min離心5 min，上清即為提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳。一抗采用抗TRIM55抗體，二抗為HRP標(biāo)記的抗體，β-actin為內(nèi)參基因。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后洗膜，再用化學(xué)發(fā)光試劑ECL對條帶進(jìn)行顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 獲得TRIM55基因敲除小鼠情況 共有孕鼠16只，產(chǎn)仔95只，飼養(yǎng)子代小鼠至4周齡。對子代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)3種基因型：野生型22只(23.16%)、TRIM55雜合子24只(25.26%)、TRIM55基因敲除49只(51.58%)。基因型鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定結(jié)果(a.PCR擴(kuò)增鑒定敲除，基因敲除=260 bp，野生型=1 196 bp；b.PCR擴(kuò)增鑒定野生型，野生型=351 bp；基因敲除為3、4、5、7，雜合子為1、8、9、11、13，野生型為2、6、10、12)

2.2 小鼠心肌組織和骨骼肌組織TRIM55基因轉(zhuǎn)錄水平 TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織的TRIM55基因轉(zhuǎn)錄水平低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 熒光定量PCR檢測TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織TRIM55基因轉(zhuǎn)錄水平(a.心肌組織；b.骨骼肌組織)

2.3 小鼠心肌組織和骨骼肌組織TRIM55蛋白表達(dá) TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織的TRIM55蛋白表達(dá)低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western Blot檢測TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織TRIM55蛋白表達(dá)(a，c.心肌組織；b,d.骨骼肌組織)

3 討論

TRIM55主要在心肌和骨骼肌中表達(dá)[4-5]，但近年來也有研究報道，TRIM55在其他組織，如肺、肝等中也有表達(dá)[10]。TRIM55作為一個E3泛素連接酶，可通過調(diào)控下游靶蛋白的泛素化來發(fā)揮生物學(xué)功能。在小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，TRIM55表達(dá)升高，其通過調(diào)控靶蛋白DUSP1泛素化水平而影響缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的凋亡[11]。TRIM55在維持骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可維持骨骼肌肌動蛋白骨架穩(wěn)定[12]。此外，TRIM55在腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移中也扮演重要角色[13]。因此，建立TRIM55基因敲除小鼠模型對于深入明確TRIM55在疾病中的作用并闡明相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

本研究通過雄性TRIM55雜合子小鼠與雌性TRIM55雜合子小鼠交配成功獲得TRIM55基因敲除小鼠。熒光定量PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示：TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織的TRIM55基因轉(zhuǎn)錄水平低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TRIM55基因敲除小鼠心肌組織和骨骼肌組織的TRIM55蛋白表達(dá)低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這驗證了本研究的基因敲除效率很高，小鼠可用于后續(xù)疾病模型及功能學(xué)實驗。

綜上所述，本研究成功建立了TRIM55基因敲除小鼠模型，為深入闡明TRIM55的作用及其機(jī)制提供了新的實驗工具。