才 藝， 趙曉杰， 張效林， 劉 丹， 田孝祥， 閆承慧

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

替格瑞洛是我國當(dāng)前使用較為普遍的抗血小板藥物[1-2]，主要經(jīng)細(xì)胞色素 P450 3A4(cytochrome P450 3A4，CYP3A4)代謝，少部分經(jīng)CYP3A5代謝，其主要代謝產(chǎn)物為AR-C124910XX。體外實(shí)驗(yàn)表明，活性代謝產(chǎn)物具有活性，可與血小板P2Y12ADP 受體結(jié)合，達(dá)到抗血小板作用，活性代謝物的全身暴露量約為替格瑞洛的30%～40%[3-6]。細(xì)胞色素P450具有表型多態(tài)性與基因多態(tài)性的特點(diǎn)，是造成個(gè)體藥物代謝差異性的主要原因，其中,CYP3A4參與多種藥物的代謝過程[7-8]。CYP3A4的表達(dá)主要取決于其細(xì)胞中微小RNA(microRNA,miRNA)的水平。有研究證實(shí)，miR-122-5p在肝組織中大量表達(dá),可作為丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌的診斷生物標(biāo)志物，用于診斷肝細(xì)胞癌癥等作用[9-13]。miR-122-5p對(duì)CYP3A4表達(dá)具有特異性調(diào)控[14-15]，但miR-122-5p對(duì)CYP3A4的調(diào)控是否與替格瑞洛的代謝存在相關(guān)性尚待證實(shí)。本研究旨在探討miRNA-122-5p 是否通過特異性調(diào)控CYP3A4的表達(dá)，從而影響替格瑞洛的代謝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和刺激 人正常肝細(xì)胞(human normal liver cell，LO2)維持在補(bǔ)充有10% FBS 的 DMEM中，溫度為37℃，濕度為5% CO2。采用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen,Carlsbad，CA)，按照制造商方案將miRNA模擬物(100 nmol/L)、miRNA抑制劑(100 nmol/L)及其對(duì)照轉(zhuǎn)染到LO2中。轉(zhuǎn)染后36 h，收集LO2。在miR-122-5p模擬物和miR-122-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后，LO2用5 μmol/L替格瑞洛刺激24 h。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法 在轉(zhuǎn)染和處理后，收集6孔板中的細(xì)胞，并在冰上用蛋白裂解液制備全細(xì)胞裂解物。蛋白質(zhì)濃度用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒(Boster)測定。全細(xì)胞蛋白質(zhì)(20 μg)在SDS-PAGE上分離并電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜與選擇性兔抗人CYP3A4多克隆抗體孵育，隨后用二抗孵育。使用化學(xué)發(fā)光試劑使條帶在暗室處曝光可視化。利用Imag J對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 RNA提取 使用TRIzol試劑提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和特定的逆轉(zhuǎn)錄引物(RiboBio)將總 RNA(2 μg)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用 KAPA SYBR?FAST qPCR 試劑盒(Kapa Biosystems，Wilmington，USA)和特異性引物(RiboBio)在 7900HT 快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行定量PCR。U6 miRNA用作miR-122-5p的內(nèi)標(biāo)，GAPDH用作CYP3A4的內(nèi)標(biāo)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，分析采用 2-ΔΔCt法。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用檢測培養(yǎng)基中替格瑞洛及其代謝物AR-C124910XX含量 準(zhǔn)確量取培養(yǎng)基200 μl，加入300 μl三氯甲烷-水溶液(2∶1)和200 μl乙腈，加入10 μl(500 ng/ml替格瑞洛-d7)內(nèi)標(biāo)液，渦旋混勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μl至35℃的氮?dú)饬飨赂稍?，將每個(gè)殘留物重新溶解在 50 μl乙腈-水(1∶1)中，以12 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測。色譜條件：色譜柱UPLC HSS C18柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40℃，流動(dòng)相：0.2%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)組成，流速設(shè)置為0.25 ml/min。正離子模式下的多反應(yīng)監(jiān)測。參數(shù)如下：ESI正電離模式，錐孔電壓為40.0 V，毛細(xì)管電壓為3.2 kV，去溶劑化溫度為450℃，離子源溫度為100℃。去溶劑化、錐孔氣體(氮?dú)?的流速分別為600、50 L/h。用于定量的離子對(duì)為替格瑞洛m/z 523.19～m/z 127.10，內(nèi)標(biāo)替格瑞洛-d7 m/z 530.23～m/z 127.1；AR-C124910XX m/z 479.18～m/z 153.06。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-122-5p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后改變LO2中miR-122-5p表達(dá) 在體外培養(yǎng)的LO2中分別轉(zhuǎn)染miR-122-5p模擬物和抑制劑后，通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-122-5p的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)，與miR-122-5p模擬物陰性對(duì)照組相比較，miR-122-5p模擬物組轉(zhuǎn)染后顯著增加LO2中miR-122-5p表達(dá)(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對(duì)照組相比較，miR-122-5p抑制劑組顯著下調(diào)了LO2中miR-122-5p表達(dá)(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同轉(zhuǎn)染組miR-122-5p的mRNA水平

2.2 miR-122-5p調(diào)控LO2中CYP3A4的蛋白表達(dá) miR-122-5p 模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后，檢測LO2中CYP3A4的蛋白表達(dá)情況。Western Blot和定量分析證實(shí)，與miR-122-5p模擬物陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p模擬物組CYP3A4的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p抑制劑組CYP3A4的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同轉(zhuǎn)染組CYP3A4的蛋白表達(dá)水平(a.CYP3A4與GAPDH的代表性蛋白質(zhì)印跡圖像；b.CYP3A4/GAPDH灰度值定量分析)

2.3 miR-122-5p下調(diào)LO2中CYP3A4的mRNA表達(dá) 在轉(zhuǎn)錄水平上，與miR-122-5p模擬物陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p模擬物組CYP3A4的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p抑制劑組CYP3A4的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同轉(zhuǎn)染組CYP3A4的mRNA水平

2.4 miR-122-5p調(diào)控CYP3A4的表達(dá)影響替格瑞洛的濃度 與miR-122-5p模擬物陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p模擬物組中細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛濃度增高，其活性代謝物AR-C124910XX的濃度顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對(duì)照組相比，miR-122-5p抑制劑組中細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛濃度降低，其活性代謝物AR-C124910XX的濃度顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX的濃度(a.不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛的濃度；b.不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)基中活性代謝物AR-C124910XX的濃度)

2.5 miR-122-5p-CYP3A4表達(dá)變化與替格瑞洛的代謝相關(guān)性 以CYP3A4相對(duì)蛋白表達(dá)為因變量，替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX的濃度為自變量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明，替格瑞洛的濃度與CYP3A4的相對(duì)蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.888，P<0.05)，活性代謝物AR-C124910XX與CYP3A4的相對(duì)蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.727，P<0.05)。替格瑞洛及活性代謝物AR-C124910XX濃度與CYP3A4相對(duì)蛋白表達(dá)的散點(diǎn)圖見圖5。

圖5 CYP3A4/GAPDH表達(dá)與替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX濃度相關(guān)性散點(diǎn)圖(a.CYP3A4/GAPDH表達(dá)與替格瑞洛濃度相關(guān)性散點(diǎn)圖；b.CYP3A4/GAPDH表達(dá)與活性代謝物AR-C124910XX濃度相關(guān)性散點(diǎn)圖)

3 討論

本研究采用LO2進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-122-5p水平，結(jié)果表明，miR-122-5p的模擬物和抑制劑能夠改變LO2中miR-122-5p水平。本研究應(yīng)用蛋白印記技術(shù)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LO2中CYP3A4的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，miR-122-5p在蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平上抑制CYP3A4的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)染后的LO2加替格瑞洛(5 μmol/L)刺激24 h，利用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛及其代謝物AR-C124910XX的濃度，結(jié)果表明，與miR-122-5p模擬物陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛的濃度升高，活性代謝物AR-C124910XX降低；與miR-122-5p抑制劑陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛的濃度降低，活性代謝物AR-C124910XX的濃度升高。本研究采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)miR-122-5p-CYP3A4表達(dá)變化與替格瑞洛的代謝相關(guān)性，結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)基中替格瑞洛的濃度與CYP3A4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，活性代謝物AR-C124910XX與CYP3A4表達(dá)呈正相關(guān)。miR-122-5p通過調(diào)控CYP3A4的表達(dá)進(jìn)而影響替格瑞洛的代謝。

CYP3A4的基因多態(tài)性是對(duì)藥物代謝影響的重要原因。Gill等[14]應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)了miR-122-5p與CYP1A2和CYP3A4的3′UTR之間的相互作用，miR-122-5p在細(xì)胞中的過表達(dá)對(duì)CYP3A4具有抑制作用。Holmberg等[16]研究結(jié)果表明，CYP3A4*22等位基因顯著降低替格瑞洛的消除，從而增強(qiáng)其抗血小板作用。CYP3A4的特異性表達(dá)與替格瑞洛的代謝具有相關(guān)性。本研究存在一定的局限性，由于研究時(shí)間短，未收集服用替格瑞洛的急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的血漿樣本，對(duì)血漿中的miR-122-5p進(jìn)行分析，沒有結(jié)合臨床患者用藥后的藥物代謝情況，具體機(jī)制還需進(jìn)一步大樣本及隨訪研究驗(yàn)證。

綜上所述，miR-122-5p通過調(diào)控CYP3A4的表達(dá)進(jìn)而影響替格瑞洛的代謝。替格瑞洛是治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征的重要藥物，深入探討藥物代謝的影響對(duì)臨床合理用藥和疾病發(fā)展的研究提供了研究基礎(chǔ)。