王 靜， 李逸明， 劉 丹， 宋海旭， 閆承慧， 田孝祥

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 錦州 121001

主動(dòng)脈疾病包括主動(dòng)脈夾層和主動(dòng)脈瘤破裂，急性起病時(shí)院內(nèi)死亡率超過60%[1]。主動(dòng)脈包括內(nèi)膜、中膜及外膜三層結(jié)構(gòu)。主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)主要位于中膜，是主動(dòng)脈數(shù)量最多的細(xì)胞類型之一，對維持主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能完整至關(guān)重要[2]。但人主動(dòng)脈組織難以獲得，多數(shù)研究采用小鼠或大鼠來源的主動(dòng)脈SMC替代[3]。這一做法的缺點(diǎn)是忽略了人與嚙齒類動(dòng)物的種屬差異，導(dǎo)致很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能解釋人主動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)制[4]。目前，關(guān)于小鼠和大鼠主動(dòng)脈SMC體外培養(yǎng)的報(bào)道較多，而對人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cell，HAoSMC)的分離及培養(yǎng)的研究較少[5]。本研究旨在探討HAoSMC的體外分離及培養(yǎng)方法，為闡明主動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人升主動(dòng)脈組織取自在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院接受外科主動(dòng)脈置換手術(shù)的A型主動(dòng)脈夾層患者。Ⅱ型膠原酶、100×抗生素溶液(每ml含10 000 U青霉素、10 mg鏈霉素、25 μg兩性霉素B)購自美國Sigma Aldrich公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自美國Thermo Fisher公司；小鼠抗SM α-actin及SM 22α一抗購自美國Abcam公司；一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板購自美國Invitrogen公司。本研究方案獲得北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 分離人主動(dòng)脈中膜 將術(shù)中得到的人主動(dòng)脈組織置于含冰的無菌生理鹽水50 ml離心管中，然后將其轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中操作。用無菌鑷子夾取主動(dòng)脈組織至10 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含有1×抗生素的冰的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗3遍。用彎鑷撕掉主動(dòng)脈內(nèi)膜，保留中膜。將中膜轉(zhuǎn)移到含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，用眼科剪將中膜剪成約2 mm寬的組織條，再將組織條剪成約2 mm長的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，靜置沉淀。移除培養(yǎng)基。

1.2.2 Ⅱ型膠原酶消化人主動(dòng)脈中膜并分離SMC 將Ⅱ型膠原酶粉末溶于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，使其終濃度為0.15%。用0.2 μm濾器過濾除菌。將沉淀的主動(dòng)脈中膜組織塊重懸于6 ml 0.15% Ⅱ型膠原酶消化液中，并將其轉(zhuǎn)移到10 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化。每小時(shí)在顯微鏡下觀察消化效果。消化10 h時(shí)，終止消化，用1 ml移液槍頭反復(fù)吹打組織塊，直至細(xì)胞脫落，組織塊明顯變小或消失。

1.2.3 培養(yǎng)分離所得SMC 將消化并吹打后的培養(yǎng)液收集至15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清。重懸于含20% FBS及1×抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并用移液管輕輕吹打，使其成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸疑接種于1個(gè)6孔板中，每孔2 ml。1 d后于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，以后每天觀察1次。第3、7、14天時(shí)在倒置相差顯微鏡下拍照記錄細(xì)胞生長情況。第3天時(shí)首次換液，去除未貼壁細(xì)胞或組織塊。以后根據(jù)細(xì)胞生長情況每3～5 d換液1次。

1.2.4 HAoSMC免疫熒光染色 將無菌蓋玻片置于24孔板中，每孔加入1 ml含20% FBS及1×抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基。取50 μl細(xì)胞懸液，加入1 ml培養(yǎng)基中制備細(xì)胞爬片。培養(yǎng)第14天吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3遍。0.1% Triton X-100通透5 min。PBS洗3遍。5%山羊血清封閉30 min。將小鼠抗SM α-actin及SM 22α一抗(1∶100稀釋)分別加到細(xì)胞爬片上，4℃孵育過夜。PBS洗3遍。將山羊抗小鼠熒光二抗(1∶100稀釋)加到細(xì)胞爬片上，室溫避光孵育30 min。PBS洗3遍。用0.5 μg/ml DAPI染核1 min。PBS洗3遍。防淬滅熒光封片劑封片。正置熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 成功獲得人主動(dòng)脈中膜組織 獲得的人主動(dòng)脈標(biāo)本中可見內(nèi)膜、中膜及外膜，且在中膜外側(cè)可見主動(dòng)脈夾層中形成的血栓(圖1a)。主動(dòng)脈的中膜與內(nèi)膜貼在一起，用鑷子可將內(nèi)膜完整的剝除，保留中膜(圖1b)。通過眼科剪可將主動(dòng)脈中膜剪成均一的寬度約2 mm的組織條(圖1c)。進(jìn)一步將組織條剪碎，可獲得約2 mm×2 mm大小的組織塊(圖1d)。

圖1 人主動(dòng)脈中膜組織分離及處理

2.2 Ⅱ型膠原酶成功消化人主動(dòng)脈中膜組織塊 0.15%Ⅱ型膠原酶消化到10 h時(shí)，鏡下可見組織塊變疏松，組織塊中可分辨出葡萄串樣細(xì)胞團(tuán)。此時(shí)終止消化，吹打組織，可見消化之前致密均一的白色中膜組織塊基本消失，僅剩少量體積較小、較疏松的白色組織塊懸浮于膠原酶中。見圖2。

圖2 人主動(dòng)脈中膜組織的膠原酶消化

2.3 HAoSMC培養(yǎng)時(shí)的生長特點(diǎn) 在培養(yǎng)1 d時(shí)，顯微鏡下可見貼壁的圓形單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；還可見懸浮于培養(yǎng)基中的無細(xì)胞基質(zhì)團(tuán)塊，即SMC從中膜分離之后殘留的血管基質(zhì)骨架。該團(tuán)塊不貼壁，后續(xù)可通過更換培養(yǎng)液去除，對細(xì)胞生長無影響。在培養(yǎng)3 d時(shí)，貼壁細(xì)胞展開，從最初的圓形變成梭形。在培養(yǎng)7 d時(shí)，大部分貼壁細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞數(shù)量增多。在培養(yǎng)14 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，基本達(dá)到融合狀態(tài)。見圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)HAoSMC生長特點(diǎn)(200倍)

2.4 體外培養(yǎng)HAoSMC標(biāo)志物染色陽性 對培養(yǎng)14 d的HAoSMC進(jìn)行SMC標(biāo)志物SM α-actin及SM 22α免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)志物染色均為陽性。SM α-actin及SM 22α主要呈細(xì)絲狀分布于細(xì)胞內(nèi)。見圖4。

圖4 HAoSMC SM α-actin及SM 22α免疫熒光染色(200倍)

3 討論

在主動(dòng)脈疾病的基礎(chǔ)研究中，多采用小鼠或大鼠主動(dòng)脈進(jìn)行SMC分離培養(yǎng)[3，6]。這樣做有以下優(yōu)勢：(1)小鼠及大鼠主動(dòng)脈容易獲取，可大量制備；(2)小鼠及大鼠個(gè)體差異小，一致性好；(3)小鼠及大鼠主動(dòng)脈較薄，易處理。但有研究發(fā)現(xiàn)，HAoSMC與小鼠、大鼠主動(dòng)脈SMC具有顯著的種屬差異[4]，對相同的病理刺激可表現(xiàn)為完全不同的生物學(xué)行為[7]。因此，大鼠及小鼠主動(dòng)脈來源的SMC不能替代HAoSMC在主動(dòng)脈疾病研究中的地位。目前，HAoSMC分離及培養(yǎng)困難主要有以下3個(gè)原因：(1)人主動(dòng)脈來源極其困難，研究人員很難獲得正常人的主動(dòng)脈作為對照，僅能從接受主動(dòng)脈置換手術(shù)的主動(dòng)脈夾層或破裂的主動(dòng)脈瘤患者中獲得主動(dòng)脈組織；(2)接受手術(shù)的主動(dòng)脈夾層或主動(dòng)脈瘤患者大多年齡較大，且存在高血壓等多種危險(xiǎn)因素，因此，分離得到的細(xì)胞易于衰老，個(gè)體差異大；(3)人主動(dòng)脈中膜厚且致密，SMC很難從中遷移出來。

本研究從人主動(dòng)脈夾層標(biāo)本中分離出主動(dòng)脈中膜，這一過程需注意以下4點(diǎn)：(1)原代取材的組織要特別注意防止細(xì)菌及真菌污染。本研究在獲得組織后，采用含有抗生素的無菌PBS清洗3遍，并在培養(yǎng)基中添加抗生素，抗生素中不僅含有針對細(xì)菌的青鏈霉素，還有針對真菌的兩性霉素B。(2)保持細(xì)胞活性。本研究在酶消化之前，均采用冰的緩沖液處理組織，以降低細(xì)胞代謝過程中的氧化應(yīng)激損傷。(3)熟練掌握主動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確區(qū)分外膜及內(nèi)膜。在剝離內(nèi)膜時(shí)，用鑷子撕除即可，不需用剪刀或手術(shù)刀銳性分離。(4)在小鼠及大鼠主動(dòng)脈SMC分離時(shí)，要將主動(dòng)脈組織塊剪成或切成1 mm3的小塊，但在實(shí)際操作中，人的主動(dòng)脈中膜很難達(dá)到這一要求。因?yàn)樾∈笾鲃?dòng)脈中膜約50～100 μm厚，由6～8層SMC及彈力板構(gòu)成[8-9]；大鼠主動(dòng)脈中膜約100～150 μm厚，由8～10層SMC及彈力板構(gòu)成[10-11]；而人主動(dòng)脈中膜厚達(dá)2～4 mm，由40～50層SMC及彈力板構(gòu)成[12]。因此，與薄而軟的小鼠或大鼠主動(dòng)脈相比，人主動(dòng)脈中膜組織厚而致密，韌性很大，很難剪小。

本研究采用膠原酶消化法對HAoSMC進(jìn)行分離培養(yǎng)。對小鼠及大鼠的主動(dòng)脈SMC分離培養(yǎng)主要有貼塊及酶消化兩種方法[13-14]。(1)貼塊法[15]：將剪碎的主動(dòng)脈中膜組織塊直接置于培養(yǎng)皿中，保持靜止不動(dòng)，使組織塊貼在培養(yǎng)皿底，SMC將在2～3周內(nèi)從組織塊中遷移出來，生長于培養(yǎng)皿底。該方法培養(yǎng)的細(xì)胞活性較好、數(shù)量多，但需要時(shí)間較長。此外，培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)皿的輕微晃動(dòng)可造成組織塊脫落，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。(2)酶消化法[16]：采用膠原酶、彈性蛋白酶等將中膜組織中的SMC分離出來。該方法分離時(shí)間短，僅需24 h即可獲得貼壁細(xì)胞。由于分離時(shí)間短，分離的細(xì)胞更貼近在體時(shí)的表型。缺點(diǎn)是細(xì)胞量較貼塊法少。本實(shí)驗(yàn)室曾成功用上述兩種方法分離得到小鼠及大鼠主動(dòng)脈SMC。但在嘗試采用貼塊法分離培養(yǎng)HAoSMC時(shí)均以失敗告終(未獲得細(xì)胞)。分析原因，可能與人主動(dòng)脈中膜厚而韌，難以剪成小組織塊，導(dǎo)致組織塊不易貼壁、SMC不易從組織塊中遷移出來有關(guān)。本研究采用的Ⅱ型膠原酶濃度為0.15%，孵育條件為37℃ 10 h。酶濃度及消化時(shí)間差異較大，可能原因如下：(1)酶的生產(chǎn)商和品質(zhì)不同，保存條件也不同，導(dǎo)致酶的活性差異較大；(2)人主動(dòng)脈組織來源于不同性別、年齡、人種、疾病狀態(tài)的患者，導(dǎo)致HAoSMC生物學(xué)特性差異較大[17-18]，影響分離及培養(yǎng)效果。由上可知，即使在消化酶得到良好質(zhì)控的情況下，主動(dòng)脈組織的差異也會(huì)使HAoSMC的分離培養(yǎng)難有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實(shí)際研究工作中，應(yīng)根據(jù)患者的不同臨床特征，總結(jié)HAoSMC分離培養(yǎng)方法的差異和經(jīng)驗(yàn)。

本研究在接種細(xì)胞前未用細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。細(xì)胞濾網(wǎng)的作用是將未消化完全的組織塊過濾掉，缺點(diǎn)是可能過濾掉細(xì)胞團(tuán)，降低收獲的數(shù)量[5]。本研究未用濾網(wǎng)，在接種1 d時(shí)發(fā)現(xiàn)單個(gè)及細(xì)胞團(tuán)均有貼壁，而未過濾掉的大的懸浮團(tuán)塊為無細(xì)胞的基質(zhì)成分，在換液時(shí)可輕松棄掉，對細(xì)胞生長無影響。在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)貼壁后細(xì)胞增殖優(yōu)于單個(gè)細(xì)胞貼壁。因此，分離HAoSMC時(shí)，在充分消化的基礎(chǔ)上，不使用細(xì)胞濾網(wǎng)可能得到優(yōu)于使用濾網(wǎng)的效果。

本研究系統(tǒng)觀察了HAoSMC的生長特性及標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果顯示：1 d時(shí)細(xì)胞貼壁，7 d時(shí)細(xì)胞成典型的長梭形，14 d時(shí)細(xì)胞基本達(dá)到融合狀態(tài)；SM α-actin及SM 22α染色均為陽性，且主要呈細(xì)絲狀分布于細(xì)胞內(nèi)。與既往研究[19-20]一致。

綜上所述，本研究采用酶消化法成功從主動(dòng)脈夾層患者標(biāo)本中分離并培養(yǎng)出HAoSMC，為進(jìn)一步闡明主動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。