劉 丹， 宋海旭， 閆承慧， 劉艷霞

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段[1-5]，心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激障礙、免疫炎癥反應(yīng)和線粒體損傷等多種因素共同參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[6-9]，但其關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。因此，闡明心力衰竭的發(fā)生機(jī)制、尋找到新的干預(yù)靶點(diǎn)，將成為心血管領(lǐng)域亟需解決的問(wèn)題。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)是一種重要的心肌保護(hù)因子[10-15]。在小鼠心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織中CREG蛋白表達(dá)明顯下降，外源性給予CREG重組蛋白后可通過(guò)影響心肌細(xì)胞自噬和凋亡顯著改善小鼠心肌缺血再灌注損傷[10]。在CREG表達(dá)缺失的雜合子小鼠中，給予血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激后，心肌纖維化明顯加重，心肌細(xì)胞自噬功能障礙[15]。然而，CREG對(duì)AngⅡ刺激后心肌細(xì)胞凋亡的影響目前尚不清楚。本研究旨在探討CREG對(duì)AngⅡ刺激后心肌細(xì)胞凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CREG抗體(Abcam公司，英國(guó))，Cleaved-caspase3抗體(剪切型的半胱天冬酶，Cell signaling technology公司，美國(guó))，Bax抗體(Cell signaling technology公司，美國(guó))，Bcl-2抗體(Cell signaling technology公司，美國(guó))，β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，HRP標(biāo)記的二抗(Jackson ImmunoResearch，美國(guó))，AngⅡ(大連美侖生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 小鼠原代心肌細(xì)胞提取及培養(yǎng) 使用膠原酶和胰酶提取出生1～3 d的小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組與AngⅡ組(1μM，刺激24 h)。此外，將CREG過(guò)表達(dá)的腺病毒(adCREG)及其對(duì)照病毒(adcon)加入到細(xì)胞上清后再給予AngⅡ刺激，24 h后收集細(xì)胞提取蛋白。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)CREG基因表達(dá) 采用Trizol方法提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用下列引物定量PCR反應(yīng)，CREG正向引物：CTTCGCGGACATCATCTCAAT,CREG反向引物：GTCAGCGTAGCCTCTGGATTT；GAPDH正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，GAPDH反向引物：GGGGTCGTTGATGGCAACA。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用蛋白裂解RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳。一抗采用抗CREG、Cleaved-caspase3抗體、Bax抗體和Bcl-2抗體；二抗使用HRP標(biāo)記的抗體，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ刺激后心肌細(xì)胞中CREG蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組與AngⅡ組的CREG基因mRNA表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1a)；但AngⅡ組CREG蛋白水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1b、c)；提示CREG表達(dá)下降可能與AngⅡ引起的心肌細(xì)胞損傷存在相關(guān)性。

圖1 AngⅡ刺激小鼠原代心肌細(xì)胞后CREG基因mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)(a.定量PCR檢測(cè)對(duì)照組和AngⅡ組小鼠原代心肌細(xì)胞CREG基因mRNA表達(dá)；b、c.Western blot檢測(cè)對(duì)照組和AngⅡ組小鼠原代心肌細(xì)胞CREG蛋白表達(dá))

2.2 構(gòu)建CREG過(guò)表達(dá)的小鼠原代心肌細(xì)胞 adCREG組CREG基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于adcon組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)，提示CREG過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞建立成功。

圖2 構(gòu)建CREG過(guò)表達(dá)的小鼠原代心肌細(xì)胞(a.定量PCR檢測(cè)adcon組和adCREG組CREG基因mRNA表達(dá)；b、c.Western blot檢測(cè)adcon組和adCREG組CREG蛋白表達(dá))

2.3 CREG過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ刺激后小鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的影響 adCREG組CREG蛋白表達(dá)明顯高于adcon組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但兩組Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。adcon+AngⅡ組CREG和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于adcon組，而Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)明顯高于adcon組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示AngⅡ刺激后心肌細(xì)胞凋亡。adCREG+AngⅡ組Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)明顯低于adcon+AngⅡ組，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)明顯高于adcon+AngⅡ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示CREG過(guò)表達(dá)可抑制AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖3。

圖3 CREG過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ刺激后小鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

心力衰竭是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，是許多心血管疾病的終末階段。雖然，科研工作者對(duì)心力衰竭的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的深入研究，但心力衰竭的發(fā)病率仍然很高。心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭的主要病理機(jī)制[16-18]。因此，明確心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子，對(duì)于深入闡明心力衰竭的發(fā)病機(jī)制，以及尋找新的干預(yù)和治療靶點(diǎn)，將具有非常重要的意義。

CREG是一個(gè)在組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)的小分子糖蛋白，具有維持組織細(xì)胞分化穩(wěn)態(tài)調(diào)控的作用。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于CREG在心血管疾病中的研究。既往研究證實(shí)，CREG具有重要的心血管保護(hù)作用：(1)CREG在心臟組織中高表達(dá)；(2)CREG在小鼠心肌缺血再灌注的心肌組織中表達(dá)下降，并且外源性給予CREG重組蛋白可通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞自噬功能來(lái)改善小鼠心肌缺血再灌注損傷[10]；(3)CREG表達(dá)降低可加重心肌梗死后心功能損傷，增加梗死后心肌纖維化，而外源性給予CREG重組蛋白后可改善心肌梗死后心功能，并顯著減輕梗死后心肌纖維化[13]；(4)CREG過(guò)表達(dá)可改善AngⅡ誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞的自噬功能[15]。

本研究采用AngⅡ刺激小鼠心肌細(xì)胞來(lái)建立心力衰竭的細(xì)胞學(xué)模型[19-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激后，CREG蛋白表達(dá)明顯下降，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)升高，提示CREG表達(dá)可能與AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡存在一定的相關(guān)性。為進(jìn)一步明確CREG在AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用，首先使用CREG過(guò)表達(dá)腺病毒感染細(xì)胞建立CREG過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞，在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，CREG過(guò)表達(dá)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究的結(jié)果與以往研究結(jié)果[11-15]一致，提示CREG是一個(gè)重要的心肌保護(hù)因子。

本研究存在一定的局限性。在本研究中，AngⅡ刺激后CREG基因mRNA表達(dá)無(wú)變化，而蛋白表達(dá)水平卻顯著下降，提示AngⅡ刺激后，CREG表達(dá)水平變化是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，在蛋白降解層面出現(xiàn)異常，后續(xù)工作中可深入研究AngⅡ刺激后CREG蛋白降解的相關(guān)途徑，如蛋白酶體途徑或溶酶體途徑。此外，本研究結(jié)果表明CREG過(guò)表達(dá)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制仍不清楚，CREG是否通過(guò)影響某些凋亡相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，AngⅡ刺激后降低心肌細(xì)胞中CREG蛋白表達(dá)，CREG過(guò)表達(dá)后可顯著抑制AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡。本研究將為深入明確心力衰竭的發(fā)病機(jī)制、尋找新的防治靶點(diǎn)提供理論支撐。