彭國穎 盧山 黃超 楊坤 萬瑋 黃長干

（1. 江西農業(yè)大學/南昌市植物資源化學利用重點實驗室，南昌 330045；2. 江西農業(yè)大學校友辦，南昌 330045）

重金屬污染日益成為影響農作物產(chǎn)量的重要因素，銅作為重金屬污染物之一，在污染土壤時具有毒性和高持久性，而植物修復技術［1］是一種很有潛力、且環(huán)保的清除環(huán)境污染的綠色技術，通過超積累植物吸收污染物來達到修復土壤、水及空氣的目的。目前，國內外研究較多的超積累植物有東南景天（Sedum alfredii）［2］、蜈 蚣 草（Pteris vittata）［3］、藍 遏 菜（Thlaspi arvens）［4］、印 度 芥 菜（Brassica juncea）［5］、車前草（Herba plantaginis）［6］等植物。紫鴨跖草（Commelina purpurea）是一種超積累銅植物［7］，其耐受銅離子的能力強于其他普通植物，在修復銅污染的土地具有一定的潛力。因此，從分子水平上研究紫鴨跖草的耐銅機制具有重要的意義。

BURP蛋白為植物特有蛋白，由一類具有相似的初級結構且含有BURP保守結構域的蛋白質［8］，在植物生長過程中，BURP蛋白不僅參與植物種子的生長發(fā)育，而且在植物抵抗非生物脅迫時也具有重要的作用［9］。BURP蛋白是由BNM2（小孢子蛋白）、USP（種子非儲存蛋白）、RD22（脫水反應蛋白）和PG1β（多聚半乳糖醛酸酶同工酶）4種蛋白質共同組成［10］，甘藍型油菜中的BNM2會參與甘藍型油菜的小孢子的產(chǎn)生及發(fā)育［11］；蠶豆種子中的USP參與種子的發(fā)育，Vokkaliga等［12］發(fā)現(xiàn)擬南芥USP基因的異位表達會影響種子的生長發(fā)育；RD22的發(fā)現(xiàn)源于擬南芥的脫水反應蛋白，其是植物應在非生物脅迫中的重要蛋白。José等［13］發(fā)現(xiàn)大豆GmRD22蛋白的異源表達會提高水稻對鹽脅迫的抗逆性，鐘活權［14］研究表明擬南芥受銅脅迫后，通過上調AtRD22的表達而提高自身的抗脅迫能力；番茄PG1β通過調節(jié)果實成熟過程中果膠的溶解的程度參與到果膠代謝中［15］。

目前，還未有關于紫鴨跖草BURP基因的報道。本研究依據(jù)紫鴨跖草的全長轉錄組數(shù)據(jù)庫，應用HMMER 3.0程序篩選出CpBURP，并克隆出CpBURP，通過運用生物信息學軟件對CpBURP蛋白的理化性質、保守結構域、磷酸化位點、二/三級結構、信號肽、跨膜結構、亞細胞定位及對同源蛋白構建系統(tǒng)進化樹等方面進行探究分析，并利用qRT-PCR分析在Cu2+脅迫下紫鴨跖草根、莖、葉中的CpBURP表達量，為后期紫鴨跖草的BURP基因的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

剪取紫鴨跖草的嫩莖，用5 g/L高錳酸鉀溶液消毒后放進霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待培養(yǎng)30 d后，嫩根長成，分別在0、50、100和300 μmol/L Cu2+的霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，以各Cu2+營養(yǎng)液培養(yǎng)的紫鴨跖草根、莖、葉為試驗材料，取樣后迅速用液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以紫鴨跖草全長轉錄組數(shù)據(jù)作為篩選BURP基因的數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 基因的篩選與克隆 從Pfma數(shù)據(jù)庫中下載BURP基因家族保守結構域的隱馬爾可夫模型（Pfam：PF03181），運用HMMER 3.0程序在紫鴨跖草的蛋白質數(shù)據(jù)庫進行搜索篩選出一個基因，再利用SMART確定其編碼的蛋白具有BURP結構域，利用NCBI確定其具有完整的開放閱讀框，將該基因命名為CpBURP。

采取Trizol法提取紫鴨跖草的總RNA，以反轉錄的cDNA為模板，依據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)設計CpBURP引物（CpBURP-F：5'-AACCCCTTCACTGCAAAGGC-3'，CpBURP-R：5'-ATCCGCGACGGTCCATGT-3'），進行基因PCR擴增。用1.5%瓊脂糖凝膠檢測、回收，將目的基因與載體pMDTM19-T連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，篩選陽性克隆進行菌液擴增并測序（普洛麥格克公司）。

1.2.2 CpBURP的生物信息學分析 運用Expasy在線軟件分析蛋白質的理化性質；運用MotifSearch在線軟件分析蛋白質的保守結構域；運用NetPhos 3.1 Server在線軟件分析蛋白質的磷酸化位點；運用Prabi在線軟分析蛋白質的二級結構；運用SWISSMODEL在線軟件分析蛋白質的三級結構；運用TMHMM在線軟件分析蛋白質的信號肽；運用SignalP 4.1 Server在線軟件分析蛋白質的跨膜結構域；運用PSOR在線軟件分析蛋白質的亞細胞定位；在NCBI中檢索擬南芥、蘋果（Malus domestica）、黃瓜（Cucumis sativus）、香瓜（Cucumis melo）、野大豆（Glycine soja Sieb）、花生（Arachis hypogaea）、木豆（Cajanus cajan）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、刺毛黧豆（Mucunapruriens）、辣椒（Capsicum annuum）、甘藍型油菜、小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）等13個物種的BURP蛋白，運用MEGA7軟件（neighbour joining tree法）將13個物種BURP蛋白與CpBURP蛋白構建系統(tǒng)進化樹、并運用EVOLVIEW在線軟件美化。

1.2.3 CpBURP的qRT-PCR分析 選取泛素連接酶（Ubiquitin，UBI）基因（UBI-F：5'-AGCACTCTTCACCTCGTCC-3'；UBI-R：5'-CTTCGCCTTCACATTCTC-3'）作為內參基因，分析CpBURP（F：5'-TTTGAAGTTTAGTAACTATGATGCG-3'；R：5'-CATTCCCATCTTGCGCATAGTTCAT-3'）的表達。利用實時熒光定量儀LightCycler 480 System進行反應，每個反應進行3次生物學重復。qRT-PCR反應程序如圖1，運用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

圖1 qRT-PCR擴增程序Fig.1 Amplification procedure of qRT-PCR

2 結果

2.1 CpBURP的克隆

以紫鴨跖草的cDNA為模板，以CpBURP-F和CpBURP-R為引物擴增出一條1 383 bp的特異性條帶（圖2-A），經(jīng)菌液PCR檢測（圖2-B）和測序，結果表明，該條帶為目的基因。

圖2 CpBURP的擴增和PCR檢測Fig.2 Amplification and PCR detection of CpBURP

2.2 CpBURP蛋白理化性質分析

CpBURP可編碼含460個氨基酸的蛋白（圖3），分子量為49.3 kD，分子式為C2153H3260N594O710S15，脂肪系數(shù)為56.37。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為51，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為42，等電點（pI）為5.46。CpBURP的不穩(wěn)定系數(shù)為26.91，為穩(wěn)定蛋白；CpBURP蛋白的總平均親水系數(shù)為-0.448，為親水蛋白（圖4）。

圖3 CpBURP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 3 CpBURP nucleotide sequence and its encoded amino acid sequence

圖4 CpBURP蛋白的親疏水性分析Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic analysis of CpBURP protein

2.3 CpBURP蛋白保守結構域

通過分析CpBURP蛋白的保守結構域（圖5），發(fā)現(xiàn)CpBURP蛋白的氨基酸序列具有一個BURP保守結構域，說明CpBURP屬于BURP基因家族。

圖5 CpBURP蛋白的保守結構域Fig.5 Conserved domain of CpBURP protein

2.4 CpBURP蛋白的磷酸化位點

CpBURP蛋白共含有50個磷酸化位點（圖6），分別是31個絲氨酸（serine）位點、14個蘇氨酸（threonine）位點和5個酪氨酸（tyrosine）位點。

圖6 CpBURP蛋白的磷酸化位點Fig. 6 Phosphorylation sites of CpBURP protein

2.5 CpBURP蛋白的二、三級結構

CpBURP蛋白的二、三級結構如圖7所示，CpBURP蛋白的二級結構是由21.09%的α螺旋、27.39%的延伸鏈、6.74%的β轉角和44.78%無規(guī)卷曲組成。

圖7 CpBURP蛋白的二、三級結構分析Fig.7 Analysis of the secondary and tertiary structure of CpBURP protein

2.6 CpBURP蛋白的信號肽及跨膜結構域分析

跨膜結構預測圖（圖8-A）顯示CpBURP蛋白不含跨膜結構，表明CpBURP蛋白不是跨膜蛋白；信號肽預測圖（圖8-B）顯示CpBURP蛋白不含信號肽，表明CpBURP蛋白不是分泌蛋白。

圖8 CpBURP的跨膜結構和信號肽分析Fig.8 Transmembrane structure and signal peptide prediction of CpBURP

2.7 CpBURP蛋白亞細胞定位

CpBURP蛋白的亞細胞定位分析表明：CpBURP蛋白定位在細胞質的可能性最高，概率為0.450；其次是過氧化物酶體，概率為0.449；定位在線粒體基質和溶酶體可能性較低，概率均為0.100。因此，推斷CpBURP蛋白作用于細胞質和過氧化酶體中的可能性較大。

2.8 構建BURP蛋白的系統(tǒng)進化樹

為了探究紫鴨跖草CpBURP蛋白與其他植物BURP蛋白之間的親緣關系，將CpBURP蛋白與13種植物的BURP蛋白構建系統(tǒng)進化樹（圖9）。系統(tǒng)進化樹顯示，14個物種的53個BURP蛋白分為6個亞類，其中CpBURP蛋白與甘藍型油菜的BURP蛋白親緣性最高，其次是擬南芥的BURP蛋白。

圖9 不同物種BURP蛋白與CpBURP蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.9 Phylogenetic tree analysis of BURP proteins and CpBURP protein of different species

2.9 Cu2+脅迫下CpBURP的表達差異分析

qRT-PCR分析結果如圖10所示，CpBURP在根中表達量最高，其次是葉和莖。隨著Cu2+濃度的增加，根、莖、葉中的CpBURP表達量均是先升高再降低，其中，根中CpBURP在100 μmol/L Cu2+脅迫后表達量最高，較對照組（0 μmol/L Cu2+）的表達量增加了約1倍，說明CpBURP在紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫中具有一定的調控作用。

圖10 CpBURP在Cu2+脅迫下的表達變化Fig.10 Expression changes of CpBURP under Cu2+ stress

3 討論

BURP蛋白在許多植物中已被鑒定出，這類蛋白質在植物無融合生殖、種子的生長發(fā)育、果膠代謝以及在重金屬離子、鹽、外源脫落酸、干旱等脅迫應激反應中發(fā)揮重要的功能［16］。目前對BURP基因的研究大多集中于模式植物（擬南芥）［17］、糧食作物（水稻、玉米等作物）［18］和經(jīng)濟作物（甘藍型油菜、蠶豆和番茄等作物）［19］，隨著越來越多植物成為基因材料研究的對象及新植物的基因組測序完成，更多物種的BURP基因將會被發(fā)掘并報道出，BURP基因的功能及作用機制也將進一步被擴展。紫鴨跖草作為一種超積累銅植物，且BURP蛋白具有抗銅脅迫的功能，因此研究CpBURP對深入了解紫鴨跖草的耐銅機制具有一定的推動作用。

因紫鴨跖草暫無基因組數(shù)據(jù)庫，本研究采用紫鴨跖草轉錄組數(shù)據(jù)庫，利用BURP蛋白的Pfam模型在HMMER 3.0程序搜索并篩選出CpBURP。本研究從紫鴨跖草中克隆出CpBURP，再利用生物信息學分析了CpBURP蛋白結構特征、功能，運用qRTPCR分析CpBURP的表達模式。CpBURP蛋白是穩(wěn)定蛋白和親水蛋白；含磷酸化位點和BURP保守結構域，不含跨膜結構和信號肽結構，預測CpBURP蛋白定位于細胞質和過氧化酶體中的概率較大。CpBURP蛋白與擬南芥和甘藍型油菜的BURP蛋白親緣性較高，進一步確定CpBURP是BURP基因。CpBURP在紫鴨跖草各組織中均有表達，在Cu2+脅迫時，根的CpBURP表達量明顯增加，說明根中CpBURP表達有利于紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫。

與動物相比，植物不能進行遷移，因此在應對生長發(fā)育過程中的各種外界環(huán)境因素的脅迫時，植物都會具有自己獨特的防御系統(tǒng)及應對機制，例如馬鈴薯（Solanum tuberosum）調節(jié)WRKY應對干旱脅迫［20］、葡萄（Vitis vinifera）調節(jié)MATE應對鹽脅迫［21］、馬藺（Iris lactea）調節(jié)HMA3應對重金屬鎘脅迫［22］、小黑楊（Opulus simonii×Populus nigra）調節(jié)CCH10應對重金屬銅的脅迫［23］等。BURP基因作為一種植物特有基因，不僅參與應對環(huán)境脅迫，還在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用。到目前為止，還沒有關于對紫鴨跖草BURP基因/蛋白的研究分析，本研究首次從紫鴨跖草中分離出CpBURP，并運用生物學工具及qRT-PCR對其進行全面分析，為后續(xù)深入解析超積累銅植物紫鴨跖草的BURP基因功能及作用機制上提供參考依據(jù)。

4 結論

克隆了全長為1 383 bp的CpBURP，其編碼的CpBURP蛋白含有BURP保守結構域，為親水蛋白，與甘藍型油菜的BURP蛋白具有較高同源性。CpBURP在根中的表達量最高，且Cu2+脅迫明顯能提高紫鴨跖草根的CpBURP表達量。CpBURP極有可能參與紫鴨跖草的耐銅應答。