胡秀文 劉華 王宇 唐雪明，5 王金斌 曾海娟 蔣瑋 李紅

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106；3. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050；4. 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；5. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，200240；6. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

核酸檢測(cè)技術(shù)在診斷感染、遺傳疾病和癌癥方面具有至關(guān)重要的作用，因此核酸檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展［1］。其中幾種主要以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)技術(shù)已被用于病原體檢測(cè)［2］，但需要昂貴的試劑和設(shè)備，以及熟練的人員。恒溫?cái)U(kuò)增方法也被應(yīng)用到核酸檢測(cè)方面［3］，由于設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的制約等因素，阻礙了核酸檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)應(yīng)用［4］。因此開發(fā)靈敏、快速和特定的傳感工具對(duì)于診斷檢測(cè)至關(guān)重要。而目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系統(tǒng)基于其準(zhǔn)確識(shí)別和切割特定DNA和RNA序列的能力，已被用于基因組編輯［5-6］，展示了其強(qiáng)大的分子檢測(cè)潛在能力，成為了開發(fā)新的檢測(cè)平臺(tái)的熱點(diǎn)。

CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌及古細(xì)菌利用Cas效應(yīng)蛋白在crRNA引導(dǎo)下抵御外源核酸入侵的一種獲得性免疫防御系統(tǒng)。研究人員在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)具有重復(fù)DNA序列的的遺傳結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由CRISPR基因座，DNA靶向間隔序列以及編碼crRNA（crispr RNA）組分和Cas蛋白操縱子的組分構(gòu)成，稱之為CRISPR-Cas系統(tǒng)［7］。它能將入侵的噬菌體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)遺傳元件（MGES）作為自己的間隔區(qū)序列，構(gòu)成了細(xì)菌和古細(xì)菌適應(yīng)性和遺傳免疫的基礎(chǔ)［8］。在自然條件下的CRISPR-Cas系統(tǒng)中，包括Cas12［9］、Cas13［10］和Cas14［11］及其同源物，會(huì)表現(xiàn)出間接的非特異性催化活性，可用于核酸檢測(cè)，例如通過降解標(biāo)記的核酸產(chǎn)生熒光信號(hào)［12］。檢測(cè)靈敏度高，達(dá)到10-18mol/L［13］的aM級(jí)別。這些系統(tǒng)借助體外擴(kuò)增技術(shù)以及橫向流動(dòng)測(cè)試條系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)低價(jià)、高靈敏度、現(xiàn)場(chǎng)可檢測(cè)的診斷方法，在人類健康到農(nóng)業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用，為更加方便、快捷的檢測(cè)各種疾病提供了技術(shù)支撐。本文主要介紹了CRISPR-Cas的相關(guān)機(jī)制，以及在核酸檢測(cè)的應(yīng)用狀況，旨為開發(fā)新型檢測(cè)平臺(tái)提供理論依據(jù)。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性與分類

CRISPR系統(tǒng)是基因編輯技術(shù)中編輯核苷酸的有效工具，與編碼Cas蛋白的相關(guān)基因組合形成CRISPR-Cas系統(tǒng)。根據(jù)所結(jié)合的Cas蛋白不同，其發(fā)揮的功能不同，主要可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩類［14］，其中第一類是多種Cas蛋白復(fù)合體，主要分為I型、III型和IV型。第二類為單一蛋白效應(yīng)模塊，主要包括II、V、VI。II型［15］系統(tǒng)的主要特征蛋白Cas9作為核酸酶行使切割能力修飾靶序列，現(xiàn)已廣泛用于許多領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究方向、食品作物開發(fā)、藥物開發(fā)和人類基因組工程等。V型［16］CRISPR-Cas系統(tǒng)的主要特征蛋白包括Cas12和Cas14。Cas12能夠誘導(dǎo)雙鏈DNA（dsDNA）切割位點(diǎn)的細(xì)胞發(fā)生遺傳變化，而且可以用于哺乳動(dòng)物的基因編輯。Cas14是從古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的新的核酸酶，它僅存在古細(xì)菌中，與Cas9、Cas12具有相似的結(jié)構(gòu)域，但功能有所差異［17］。VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)使用Cas13核酸酶，該酶具有特征性的較高的真核和原核核苷酸（HEPN）結(jié)合結(jié)構(gòu)域［18］，特異性的作用于RNA靶序列，發(fā)揮特異性識(shí)別和非特異切割的功能。除此之外，CRISPR系統(tǒng)都可以利用靶向切割與體外擴(kuò)增相結(jié)合，從而用于快速檢測(cè)DNA和RNA，達(dá)到快速檢測(cè)的目的［19］，具有良好的應(yīng)用前景。

2 CRISPR-Cas核酸檢測(cè)工具

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)概述

CRISPR-Cas9屬 于CRISPR II型 系 統(tǒng)，含 有HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域，是由Cas9蛋白、tracrRNA與crRNA一起組合對(duì)目的基因進(jìn)行編輯。Cas9能夠識(shí)別質(zhì)粒和噬菌體的原型間隔序列毗鄰基序（PAM）［20］NGG序 列，然 后crRNA-tracrRNA復(fù) 合體與cDNA配對(duì)，從而導(dǎo)致Cas9對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行雙鏈切割。其中crRNA-tracrRNA復(fù)合物可以合成向?qū)NA（sgRNA）來直接引導(dǎo)該系統(tǒng)識(shí)別目標(biāo)序列。CRISPR-Cas9可以與光學(xué)DNA定位結(jié)合起來以鑒定細(xì)菌抗生素抗性基因［21］；另外，將CRISPR-Cas9與DNA熒光原位雜交（FISH）結(jié)合以檢測(cè)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）［22］。

Cas9核酸酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后會(huì)沒有活性即為dCas9（dead Cas9），可用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，可以結(jié)合DNA而不將其裂解，基于此特點(diǎn)開發(fā)了一種dCas9的體外DNA檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)以高特異性和高靈敏度檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA［23］。目前的研究顯示，使用Cas9來切割DNA也存在一些問題。如在切割過程中目標(biāo)序列識(shí)別不準(zhǔn)確容易導(dǎo)致突變，而且雙鏈斷裂引起的大片段堿基缺失，并因此導(dǎo)致臨床應(yīng)用的嚴(yán)重后果等。另外，該系統(tǒng)需要crRNAtracrRNA復(fù)合物來識(shí)別靶核酸，比其他類別識(shí)別復(fù)雜一些。

2.2 CRISPR-Cas12技術(shù)概述

CRISPR相 關(guān) 蛋 白Cas12a，是 第 二 類V型CRISPR系統(tǒng)RNA引導(dǎo)的一種核酸內(nèi)切酶、具有附帶的裂解活性，也含有RuvC結(jié)構(gòu)域，并在crRNA引導(dǎo)下切割PAM（TTTN）序列下游18-25 nt的靶DNA。Casl2a在crRNA的介導(dǎo)下靶向結(jié)合dsDNA，形成了三元復(fù)合物，激活了非特異性ssDNA反式裂解活性［24］?；贑as12a 這一特殊性質(zhì)，將Casl2a反式切割活性與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合的方法，開發(fā)了一種新DNA檢測(cè)方法—DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）［25-26］。該 系 統(tǒng) 結(jié) 合重組聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)與熒光報(bào)告系統(tǒng)，對(duì)靶DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，然后Cas12a在crRNA引導(dǎo)下作用于擴(kuò)增的靶DNA，裂解淬滅的ssDNA報(bào)告基因，產(chǎn)生熒光信號(hào)?，F(xiàn)已將該系統(tǒng)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中［27］，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品快速靈敏的檢測(cè)，其DNA檢測(cè)的靈敏度能達(dá)到aM級(jí)；在醫(yī)療診斷檢測(cè)上可以對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）患者的樣本檢測(cè)分析［28］。趙國(guó)屏團(tuán)隊(duì)利用Cas12a以及熒光報(bào)告系統(tǒng)，成功開發(fā)了高靈敏核酸檢測(cè)方法HOLMES［25］（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system），用于目標(biāo)DNA和RNA的快速檢測(cè)，該方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，以及對(duì)DNA病毒（偽狂犬病病毒）以及RNA（乙型腦炎）病毒檢測(cè)，暗示著Cas12a在核酸檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。但是，該方法也存在一些缺點(diǎn)，如反應(yīng)溫度高、SNP檢測(cè)序列受限、靈敏度可能降低等。為了檢測(cè)更加方便，基于Cas12a切割機(jī)制，開發(fā)了一種新型的一體式工具箱，具有精確和超靈敏性（OCTOPUS）平臺(tái)［29］，成功應(yīng)用于食源性病原體檢測(cè)，為食品安全提供了保障。通過研制的CRISPR-Cas12a生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)烏拉西-DNA糖酶（UDG）和T4多核苷酸激酶（T4 PNK）的超敏感檢測(cè)［30］，而且可作為確定包括單細(xì)胞解氧和人體血漿在內(nèi)的真實(shí)樣品的強(qiáng)大工具箱［31］，證明良好的實(shí)際應(yīng)用能力。

隨著對(duì)Cas不斷深入的探究，Cas12的另一個(gè)常用核酸蛋白Cas12b被發(fā)掘出來，它含有單個(gè)的RuvC結(jié)構(gòu)域，脫靶效率低，能在哺乳動(dòng)物和人類中進(jìn)行有效的基因的編輯［32］。同時(shí)也顯示出相同的DNA 反式切割活性，根據(jù)此特性，創(chuàng)建了HOLMES的改進(jìn)版本（稱為HOLMESv2）［33］。在HOLMESv2系統(tǒng)中，Cas12b可以和各種恒溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，并將擴(kuò)增與Cas12b檢測(cè)兩個(gè)獨(dú)立的步驟整合到一個(gè)系統(tǒng)中特異性區(qū)分單核苷酸多態(tài)性（SNP），避免了交叉污染，用最少的設(shè)備提供超靈敏和特異的DNA檢測(cè)的潛力。為了更加快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，將Cas12a 與Cas12b效應(yīng)器與LAMP整合在一起，以開發(fā)一種超靈敏的特異性側(cè)向流生物傳感器（LFB），用于檢測(cè)銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）［34］。但是目前該系統(tǒng)無法直接檢測(cè)RNA分子，需要對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，增加了檢測(cè)的復(fù)雜程度，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 CRISPR-Cas13技術(shù)概述

Cas13［35］是VI型CRISPR系統(tǒng)相關(guān)的蛋白，是RNA引導(dǎo)和RNA靶向的核糖核酸酶（RNase）蛋白家族［36］，Cas13含有2個(gè)發(fā)散的HEPN結(jié)構(gòu)域［37］，可以在具有Protospacer側(cè)翼位點(diǎn)（PFS）的靶標(biāo)RNA的單鏈區(qū)域中產(chǎn)生多個(gè)切割位點(diǎn)。且Cas13［38］還表現(xiàn)出靶標(biāo)依賴性的混合RNase活性，導(dǎo)致非靶標(biāo)RNA分子的反式切割。Cas13可以實(shí)現(xiàn)RNA編輯，如RNA堿基編輯技術(shù)（REPAIR）［39］。另外該系統(tǒng)在核酸檢測(cè)和疾病診斷中也顯示出獨(dú)特而廣泛的用途，是開發(fā)快速檢測(cè)工具的研究熱點(diǎn)之一。

目前研究人員對(duì)于Cas13a核酸蛋白研究較多，基于其附屬切割的特點(diǎn)建立了SHERLOCK［40］（特定的高靈敏度酶報(bào)告解鎖）平臺(tái)，并將恒溫?cái)U(kuò)增與Cas13a相結(jié)合來檢測(cè)RNA分子。SHERLOCK程序在運(yùn)行的過程中主要分為4個(gè)階段，分別為試劑制備、樣品提取、核酸恒溫預(yù)擴(kuò)增和CRISPR-Cas13核酸檢測(cè)［41］。該系統(tǒng)依賴于RNA熒光報(bào)告探針對(duì)信號(hào)的級(jí)別放大，再借助T7轉(zhuǎn)錄結(jié)合重組聚合酶擴(kuò)增［42］實(shí)現(xiàn)了對(duì)信號(hào)的二次放大，提高了該方法的靈敏度，對(duì)病毒核酸實(shí)現(xiàn)了單分子靈敏度和單堿基特異性檢測(cè)。為此通過結(jié)合CRISPR-Cas13a系統(tǒng)和催化組件（CHA），建立了非編碼小RNA分子（miRNA）的超敏電化學(xué)生物致敏平臺(tái)［43］。

通過Cas13a與熒光報(bào)告基團(tuán)或橫向流動(dòng)試紙條結(jié)合，形成了Cas13a系統(tǒng)，并成功在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)到犬細(xì)小病毒2型（CPV-2）［44］；能夠檢測(cè)血漿EB病毒（epstein-barr virus）DNA，進(jìn)而有助于篩查和監(jiān)測(cè)鼻咽癌及其他EBV相關(guān)疾?。?5］。Gootenberg等［46］將SHERLOCK方法修改，開發(fā)了SHERLOCKv2平臺(tái)，該平臺(tái)結(jié)合Cas13a與輔助CRISPR-III型相關(guān)核酸酶Csm6［47］使信號(hào)靈敏度提高了3.5倍。在多功能、快速、便攜和經(jīng)濟(jì)高效的核酸檢測(cè)上，具有全分子敏感性和單堿基檢測(cè)特異性，為基礎(chǔ)設(shè)施欠發(fā)達(dá)地區(qū)的流行病監(jiān)測(cè)和病原體檢測(cè)提供了技術(shù)支持。為了避免污染，引入未提取的診斷樣品加熱以消除核酸酶（HUDSON）［41］方案，可以直接從臨床樣品中檢測(cè)病毒核酸，達(dá)到以極高的靈敏度檢測(cè)全血、血清和唾液中的病毒。根據(jù)CRISPR-Cas13系統(tǒng)的反式切割活性而建立的檢測(cè)平臺(tái)成功應(yīng)用多個(gè)領(lǐng)域，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)宿主轉(zhuǎn)錄組的非靶點(diǎn)影響很小，這可能導(dǎo)致非預(yù)期突變。另外，分子量較小的分子也給CRISPR-Cas13多重檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)。因?yàn)镾herlock的RNA報(bào)告程序容易被環(huán)境中存在的RNA酶降解，而ssDNA報(bào)告程序則不易激活，因此由于取消了體外轉(zhuǎn)錄過程，DETECTR更便于DNA檢測(cè)。

2.4 CRISPR-Cas14技術(shù)概述

Cas14屬 于V型CRISPR-Cas系統(tǒng) 由RNA引導(dǎo)的核酸酶家族，大小只有400到700個(gè)氨基酸，迄今為止被證明是最小的第二類CRISPR效應(yīng)器。它是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶，與CRISPRCas12a不同，它不需要PAM就可以激活，識(shí)別之后進(jìn)行靶向切割時(shí)表現(xiàn)出與Cas12a不同的保真度機(jī)制［17］，即靶向識(shí)別后所釋放的非特異性催化活性，這種機(jī)制類似于ssRNA靶向Cas13a酶的機(jī)制，例如通過降解標(biāo)記的核酸以產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此可以根據(jù)Cas12與Cas13的作用機(jī)制來理解Cas14的切割特性。各種CRISPR檢測(cè)系統(tǒng)比較如表1。

表1 CRISPR檢測(cè)系統(tǒng)比較Table 1 Comparison of CRISPR detection system

基于Cas14的這種非特異性DNase活性，開發(fā)了ssDNA檢測(cè)平臺(tái)DETECTR-Cas14［48］。但在診斷用途上，與Cas12a相關(guān)的檢測(cè)平臺(tái)DETECTR［25］相比，其在區(qū)分ssDNA底物方面表現(xiàn)出較高的保真度，可用于DNA單核苷酸多態(tài)性基因分型、ssDNA病原體的檢測(cè)與診斷。CRISPR-Cas14系統(tǒng)還可以與HUDSON［42］方法結(jié)合使用，不涉及復(fù)雜的樣本提取和運(yùn)輸，達(dá)到快速檢測(cè)病毒的目的，并已成功應(yīng)用于細(xì)小病毒檢測(cè)人類博卡病毒（HBoV1）［11］。這項(xiàng)新的診斷技術(shù)的精準(zhǔn)性在檢測(cè)人類E3泛素蛋白連接酶（HERC2）基因方面已經(jīng)得到證明。CRISPRCas14是高通量病原突變篩查的一種有效且經(jīng)濟(jì)高效的方法，而目前在檢測(cè)之前，需要額外的步驟從dsDNA靶標(biāo)生成ssDNA。Cas14的這一特殊性質(zhì)可能會(huì)增加其應(yīng)用的復(fù)雜性；因此，到目前為止，它在診斷應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)還沒有清楚地展示出來。

2.5 CRISPR核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

許多已發(fā)表的CRISPR檢測(cè)方法需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增，但標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增方法PCR需要熱循環(huán)儀，不方便攜帶且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，并不適用。目前研究較多的是與等溫?cái)U(kuò)增放大的多種技術(shù)，最常用的等溫放大方法是RPA和LAMP，它們的工作溫度分別在37-42℃、65℃，利用CRISPR與RPA結(jié)合建立了DETECTR、SHERLOCK等一系列檢測(cè)平臺(tái)。并結(jié)合動(dòng)態(tài)水相反應(yīng)（DAMR）系統(tǒng)和蔗糖濃度的密度差異建立兩相一體式反應(yīng)進(jìn)行核酸檢測(cè)［49］。HOLMESv2系統(tǒng)與LAMP擴(kuò)增結(jié)合，在恒溫條件下，Cas12b檢測(cè)結(jié)合LAMP擴(kuò)增并經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理可以準(zhǔn)確定量目標(biāo)DNA甲基化程度［33］。滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）是一種高度特異的等溫基因擴(kuò)增方法，可以在室溫下進(jìn)行，輔助CRISPR-Cas9檢測(cè)多個(gè)胞外囊泡小RNA［50］。核酸序列擴(kuò)增（NASBA）是一種用來擴(kuò)增RNA的方法，需要一個(gè)初始加熱步驟（65℃），然后在41℃下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，與CRISPR-Cas9結(jié)合與可準(zhǔn)確區(qū)分密切相關(guān)的寨卡病毒株［51］。

2.6 CRISPR比色讀出檢測(cè)系統(tǒng)

在CRISPR檢測(cè)中，色度傳感器的使用很受歡迎，因?yàn)樗梢灾苯訉⒔Y(jié)果可視化。其中包含側(cè)向流動(dòng)分析（LFA），CRISPR-Cas9結(jié)合側(cè)向流動(dòng)核酸測(cè)定［52］（CASLFA）用于鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和非洲豬瘟病毒（ASFV）。有研究人員采用了一種基于膠體金納米顆粒（AuNP）［53］的比色分析方法，以及鉑納米顆粒（PtNPs），再加入Cas12a和Cas13a效應(yīng)蛋白來檢測(cè)目標(biāo)序列，通過他們的體積條形圖芯片，可以識(shí)別和檢測(cè)血清中的多種癌癥基因突變。

2.7 CRISPR識(shí)別輸出檢測(cè)系統(tǒng)

研究人員通過將CRISPR切割與電子信號(hào)輸出系統(tǒng)結(jié)合，能夠準(zhǔn)確的觀察到結(jié)果的變化，而且不需要目標(biāo)放大就可以在非常低的濃度下進(jìn)行測(cè)量。CRISPR-dCas9借助基于石墨烯的場(chǎng)效應(yīng)晶體管（GFET）和納米孔傳感器［54］，通過識(shí)別目標(biāo)序列來影響電子信號(hào)的輸出，利用Cas12a的反式切割檢測(cè)報(bào)告DNA片段，有效解決了低濃度目標(biāo)DNA的檢測(cè)時(shí)間問題。電化學(xué)傳感系統(tǒng)［55］利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導(dǎo)信號(hào)，而不需要進(jìn)行DNA擴(kuò)增，通過電流差異表明目標(biāo)DNA的存在。

3 CRISPR系統(tǒng)在新冠病毒檢測(cè)的應(yīng)用

新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起新冠肺炎，并已導(dǎo)致國(guó)際公共衛(wèi)生緊急情況，截止到2021年3月已傳播到200多個(gè)國(guó)家，全球已感染1億2 040萬人，死亡近200多萬人。研究表明，感染SARS-CoV-2的個(gè)體在無癥狀或有癥狀前可能具有高度感染性，并且感染者平均可感染5.6個(gè)體［56］，這種情況亟需快速、靈敏的SARS-CoV-2診斷分析方法。檢測(cè)病毒的存在性對(duì)于降低病毒的基本繁殖率和最佳臨床時(shí)間窗口都是至關(guān)重要的。目前采用RT-qPCR診斷COVID-19是主要的手段，但此方法需要專業(yè)的技術(shù)人員，且試劑和設(shè)備的獲取不足減緩了疾病檢測(cè)的速度。為了進(jìn)一步提高新冠肺炎的診斷水平，基于CRISPR系統(tǒng)的檢測(cè)新冠肺炎的方法，因其準(zhǔn)確、快速的診斷檢測(cè)而成為熱點(diǎn)。而目前報(bào)道出的在新冠病毒方面應(yīng)用的主要是基于Cas12與Cas13的檢測(cè)技術(shù)，故基于CRISPR的平臺(tái)目前是準(zhǔn)確檢測(cè)和治療SARS-CoV-2的一種合理的新方法。

3.1 基于CRISPR-Cas12a的診斷工具

研究者們?cè)贑RISPR系統(tǒng)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了各種新的診斷方法，其中利用CRISPR-Cas12a［57］系統(tǒng)DETECR的檢測(cè)平臺(tái)，通過將CRISPR-Cas12a與RT-PCR結(jié)合將從鼻拭子中提取的病毒RNA中進(jìn)行擴(kuò)增，后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至CRISPR-Cas12a的系統(tǒng)中進(jìn)行熒光檢測(cè)，利用簡(jiǎn)易的設(shè)備即可進(jìn)行遠(yuǎn)程檢測(cè)，并在短時(shí)間內(nèi)觀察到結(jié)果。其結(jié)果也可通過側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)方法進(jìn)行觀察［58］，用于檢測(cè)呼吸道提取物中的SARS-CoV-2。為了更能方便操作者，研究人員開發(fā)了一種快速、靈敏的肉眼可視的檢測(cè)方法（CRISPR-Cas12a-NER）［59］，具有肉眼讀數(shù)，無需特殊儀器即可在45 min 內(nèi)檢測(cè)到，從而提供了一種簡(jiǎn)單可靠的現(xiàn)場(chǎng)診斷方法。目前還將等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR-Cas12技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種快速檢測(cè)臨床標(biāo)本中SARS-CoV-2的方法［60］。該方法使用環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增（RT-LAMP）對(duì)從鼻咽或口咽拭子中提取的RNA執(zhí)行同時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增，隨后對(duì)冠狀病毒序列進(jìn)行Cas12檢測(cè)，利用其附屬切割確認(rèn)了病毒的存在，極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間，提供了快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

3.2 基于CRISPR-Cas13a的診斷工具

隨著新冠疫情的發(fā)展，張峰團(tuán)隊(duì)提出了基于CRISPR的SHERLOCK技 術(shù) 來 檢 測(cè)SARS-CoV-2的新方法［61］。該方法分為3個(gè)步驟，從核酸提取開始，在1 h內(nèi)即可完成，用于定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。首先使用重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）試劑盒對(duì)提取的核酸樣本進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；再使用Cas13檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增的病毒RNA序列；最后借助儀器可以使用肉眼讀出檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)［62］。Arizti-Sanz團(tuán)隊(duì)開發(fā)的SHINE方法［63］，則將SHERLOCK可以與HUDSON搭配使用，這是一種靈敏而特異的集成診斷工具，可以從未提取的樣本中檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA。它通過使用加熱和化學(xué)還原來破壞降解RNA的核酸酶和裂解病毒顆粒，消除提取核酸的步驟，用于免提取、快速和靈敏地檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA。這是一種簡(jiǎn)單的方法，可以用最少的設(shè)備從未提取的患者樣本中檢測(cè)病毒RNA，降低了樣本污染的風(fēng)險(xiǎn)。此方法顯示出了其在新冠肺炎大流行期間大量的診斷需求，這些研究進(jìn)展可以極大地提高診斷檢測(cè)的能力，為抗擊傳染病提供必要的工具。

4 小結(jié)

CRISPR-Cas系統(tǒng)具有高效性、特異性等特征，因此被科學(xué)家們廣泛推崇，隨著對(duì)這些系統(tǒng)的組成和功能的不斷開發(fā)，CRISPR核酸檢測(cè)應(yīng)用將繼續(xù)擴(kuò)大。本文中列舉了CRISPR-Cas系統(tǒng)用于識(shí)別和檢測(cè)不同目的的特定核酸，包括基因組DNA、非基因組DNA、RNA和病原微生物的檢測(cè)。開發(fā)出的新型檢測(cè)平臺(tái)DETECTR與SHERLOCK也具有良好的臨床檢驗(yàn)傾向，使得檢測(cè)變得快捷、靈敏。并且可以集成到基于比色或熒光的便攜式設(shè)備中，從而可以在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施。當(dāng)特定的報(bào)告核酸被不同的熒光分子標(biāo)記時(shí)，它們也可以被多重化。然而，多種酶的使用、反應(yīng)時(shí)間和步驟使方法變得復(fù)雜，此外，基于熒光的技術(shù)會(huì)產(chǎn)生熒光本底，因此需要嚴(yán)格的優(yōu)化。該系統(tǒng)目前在病毒檢測(cè)快速應(yīng)用上也表現(xiàn)出了的巨大潛力，會(huì)對(duì)疫情的防控提供有力的技術(shù)支撐?？傊瑢?duì)系統(tǒng)的優(yōu)化和進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，有望給核酸檢測(cè)、基礎(chǔ)研究、傳染病和單堿基突變的遺傳病、腫瘤的診斷和治療等帶來革命性影響。之后研究重點(diǎn)可以主要放在高通量檢測(cè)和多重序列方向上進(jìn)行檢測(cè)。