王婷 楊陽(yáng) 李金萍 杜坤

（1. 揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，揚(yáng)州 225009）

轉(zhuǎn)基因（genetically modified，GM）作物是一類利用基因工程技術(shù)將外源的有益基因?qū)氲阶魑锘蚪M中并穩(wěn)定遺傳，以獲得更加優(yōu)良的農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物。自1996年第一例轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化應(yīng)用以來(lái)，各種轉(zhuǎn)基因作物不斷問(wèn)世，且種植面積也不斷擴(kuò)大。目前，全球共有27種轉(zhuǎn)基因作物的387個(gè)轉(zhuǎn)化體被批準(zhǔn)可用作糧食或飼料。全轉(zhuǎn)基因作物的總種植面積從1996年的170萬(wàn)公頃增加到2018年的191.7萬(wàn)公頃（ISAAA，2019）。根際導(dǎo)入外源基因的類別，可以把轉(zhuǎn)基因作物分為4類：（1）耐除草劑類，（2）抗蟲類，（3）抗病類，（4）其他（品質(zhì)相關(guān)、抗逆等）。

由于外源基因來(lái)源的多樣化和植物發(fā)育的不可預(yù)測(cè)性，轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植之前都必須通過(guò)系統(tǒng)、深入的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)［1］。其中，土壤作為生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所，對(duì)外界環(huán)境的變化比較敏感，已被公認(rèn)為是生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警指標(biāo)之一［2］。本文綜述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落影響方面的研究進(jìn)展，并對(duì)轉(zhuǎn)基因作物土壤安全評(píng)價(jià)中還應(yīng)注意的問(wèn)題進(jìn)行了探討和展望。

1 土壤微生物群落的研究方法

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物群落的主要研究方法有微生物平板培養(yǎng)法、Biolog微孔板法、生物標(biāo)記物法和高通量測(cè)序技術(shù)4類。

土壤中的微生物可以通過(guò)經(jīng)典的微生物平板培養(yǎng)方法直接檢測(cè)出，但土壤微生物種類繁多，可培養(yǎng)的微生物只占所有土壤微生物的10%左右［3-4］，這種方法只能反映出土壤中一部分微生物的變化情況。因此，微生物平板培養(yǎng)法現(xiàn)在大多被用來(lái)篩選一些具有某些特定功能的可培養(yǎng)微生物。

Biolog微孔板法是根據(jù)微生物對(duì)特定碳源利用方式的差異，來(lái)測(cè)算微生物群落代謝的功能多樣性，即細(xì)菌群落代謝指紋［5］。Biolog微孔板有多種類型，目前以Biolog-ECO 1506應(yīng)用最為廣泛。它含有3組縱向排列的平行重復(fù)，每組含有31種碳源（分別是糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類六大類）和1個(gè)空白對(duì)照。由于不同微生物對(duì)碳源的利用方式有一定差異，因此就可用于比較不同微生物群落之間的代謝差異。這種方法已被廣泛的應(yīng)用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物（如玉米、水稻、小麥和大豆）對(duì)根際土壤微生物群落的影響［6-9］。Biolog微孔板法雖然具有靈敏度高、培養(yǎng)周期短、檢測(cè)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些局限性，如人工培養(yǎng)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響等［10］。

土壤微生物主要由細(xì)菌、真菌和放線菌等組成，不同微生物細(xì)胞膜中特定化合物（如醌和脂肪酸）的類型和含量存在一定差異，將這些化合物作為生物標(biāo)記物，就可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的定量分析，其中應(yīng)用最多的就是磷脂脂肪酸（PLFA）圖譜法［11］。常用的細(xì)菌特征PLFA有i15：0、a15：0、15：0、i16：0、16：1ω9、16：1ω7t、i17：0、a17：0、17：0、18：1ω7、cy19：0，真 菌 特 征PLFA有18：1ω9、18：2ω6、18：3ω3；革蘭氏陽(yáng)性菌的特征PLFA有16：0（10Me）、17：0（10Me）、18：0（10Me）、i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、a17：0，革蘭氏陰性菌的特征PLFA有16：1ω5、16：1ω7t、16：1ω9、cy17：0、18：1ω5、18：1ω7和cy19：0［12］。由于PLFA方法直接以土壤微生物群落中的脂肪酸為研究對(duì)象，解決了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法中缺失不可培養(yǎng)微生物信息的問(wèn)題［13］。但是，PLFA生物標(biāo)記方法只適用于活的微生物，且不同種類的微生物可能會(huì)產(chǎn)生重疊的圖譜，故此方法一般被用作為微生物群落研究的一種必要補(bǔ)充。

分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化十分敏感，可以檢測(cè)細(xì)菌組成的微小差異，其在探索微生物群落多樣性，尤其是鑒定微生物新物種方面發(fā)揮了一定的優(yōu)勢(shì)。常用的方法有熒光原位雜交法（FISH）、DNA微陣列法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）法、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）法、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）法、變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）法等。其中，DGGE技術(shù)是被運(yùn)用于土壤微生物群落研究中最多的方法。這些分子生物學(xué)方法具有靈敏度高、不用培養(yǎng)微生物等優(yōu)點(diǎn)，可以更好的反應(yīng)土壤微生物的真實(shí)狀況。但是缺點(diǎn)也很明顯，如DGGE中能夠檢測(cè)到的微生物群落通常是具有顯著優(yōu)勢(shì)度的菌落，同一條帶可能代表DNA分子遺傳圖譜中的多種微生物物種［14］。

隨著分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，尤其是下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)的廣泛應(yīng)用，極大的提高了土壤微生物學(xué)的研究廣度和深度［15-16］。高通量測(cè)序技術(shù)主要包括 454 焦磷酸、ABI SOLiD、Illumina Hiseq 2000 及Illumina Miseq、Hecos Heliscope和PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)。近年來(lái)，這些高通量測(cè)序已逐漸代替了DGGE技術(shù)，尤其是以單分子和長(zhǎng)讀長(zhǎng)為主要特征的三代測(cè)序技術(shù)，逐漸成為微生物群落研究領(lǐng)域的主要分析方法［17］。如PacBio 16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，首先對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果（raw reads）進(jìn)行校正、過(guò)濾和去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)（clean reads），然后將clean reads聚類為OTUs，并對(duì)其進(jìn)行物種注釋，獲得分類學(xué)信息。再使用Qiime等軟件計(jì)算Observed-OTUs，Chao1，Shannon，Simpson等Alpha多樣性指數(shù)，計(jì)算Unifrac距離，構(gòu)建PCoA和UPGMA聚類樹圖，并進(jìn)行組間差異分析。最后運(yùn)用Anosim、MRPP、ADONIS、t-test等統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)組間物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

宏基因組測(cè)序是以特定生境中的整個(gè)微生物群落作為研究對(duì)象，直接提取環(huán)境樣本DNA，通過(guò)采用新一代測(cè)序技術(shù)，獲得環(huán)境微生物基因信息的總和［18］。與高通量測(cè)序不同的是，Clean Reads需經(jīng)過(guò)Metagenome 組裝后，進(jìn)行常用功能數(shù)據(jù)庫(kù)、抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋和一系列高級(jí)信息分析（如CCA/RDA分析，拷貝數(shù)變異分析等）。同時(shí)，還可結(jié)合環(huán)境因子、病理指標(biāo)或特殊表型進(jìn)行深入關(guān)聯(lián)分析。宏基因組測(cè)序技術(shù)避免了實(shí)驗(yàn)中由環(huán)境引起的微生物變化的差異，更真實(shí)地反應(yīng)樣本中微生物組成和互作情況，可在分子水平對(duì)其代謝通路、基因功能進(jìn)行更加深入的研究［19］。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指從整體水平上研究某一特定環(huán)境，特定時(shí)期群體生命所有基因組的轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。相較于宏基因組測(cè)序，它以生態(tài)環(huán)境中的全部RNA為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄水平上研究復(fù)雜微生物群落的變化，可以更好的挖掘潛在的新基因［20］。

2 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物影響的研究進(jìn)展

轉(zhuǎn)基因作物在給我們帶來(lái)效益的同時(shí)，外源基因的導(dǎo)入是否會(huì)引起土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，這是我們急需回答的問(wèn)題。為此，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者做了大量的研究工作，但目前還沒(méi)有明確的結(jié)論表明轉(zhuǎn)基因作物是否一定會(huì)對(duì)土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)、不利的影響。

2.1 抗蟲類轉(zhuǎn)基因作物

已轉(zhuǎn)入作物中的抗蟲類基因主要包括：蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因、核糖體失活蛋白基因和豌豆脂肪氧化酶基因等［21］。目前，在評(píng)估抗蟲類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非靶標(biāo)土壤微生物影響的研究中，最多的是Bt基因和CpT1基因（表1）。

表1 抗蟲類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落的影響Table 1 Impact of insect-resistant GM crops on soil microbial communities

上述研究中，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對(duì)根際土壤微生物群落無(wú)顯著影響，或遠(yuǎn)小于作物不同生育期和種植年份。如在轉(zhuǎn)基因棉花中，研究學(xué)者已經(jīng)運(yùn)用多種研究方法（包括CFUs、qPCR、T-RFLP、PCR-DGGE和16S rRNA基因高通量測(cè)序）分析了轉(zhuǎn)CrylAc+CpTI 基因棉花對(duì)根際土壤微生物的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花根際土壤中的細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)菌群種類、物種相對(duì)豐度、群落多樣性等指標(biāo)與對(duì)照相比差異并不顯著［28，30，32-33，40］。Liang等［41］的高通量測(cè)序結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Cry1Ie 基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的根際土壤細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)均無(wú)顯著差異，而主成分分析卻顯示苗期、花期、成熟期之間或不同試驗(yàn)?zāi)攴葜g的卻存在顯著差異。

另一方面，Zhu等［45］和Han等［47］利用同位素探測(cè)技術(shù)結(jié)合基因克隆文庫(kù)分析顯示，雖然Bt水稻、親本Ck和遠(yuǎn)源親本Dp三種水稻的根際土壤中占優(yōu)勢(shì)的微生物都是產(chǎn)甲烷古菌群落，但其中Bt水稻根際活躍的產(chǎn)甲烷古菌群落以甲烷八疊球菌科、甲烷鬃菌科和甲烷微菌科為主，而Ck和Dp水稻根際只有兩個(gè)主要產(chǎn)甲烷菌群（甲烷鬃菌科和甲烷微菌科）。這些結(jié)果表明，將Cry1Ab/1Ac基因插入水稻基因組中，有可能通過(guò)改變根系產(chǎn)甲烷底物的分泌（如氨基酸、糖、可溶性碳水化合物、檸檬酸、乙酸和總有機(jī)酸等）、根系衰老過(guò)程或光合作用等其他途徑，改變了水稻根際產(chǎn)甲烷群落的結(jié)構(gòu)組成。Van wyk等［48］通過(guò)Illumina MiSeq 測(cè)序技術(shù)研究了成熟期Bt玉米和非Bt玉米的根際土壤細(xì)菌物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，兩者細(xì)菌alpha多樣性和群落組成存在顯著差異，變形菌門和酸桿菌門是Bt玉米根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌，而非Bt玉米根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌則是放線菌門。通過(guò)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)Bt玉米與對(duì)照根際土壤的有機(jī)碳、硝酸鹽含量以及土壤酸性磷酸酶和β-葡萄糖苷酶活性也存在顯著差異。這些土壤理化性質(zhì)和相關(guān)酶活性的差異可能是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的主要原因。

2.2 抗病類轉(zhuǎn)基因作物

在評(píng)估抗病類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落影響的研究中，研究較多的是轉(zhuǎn)抗真菌和抗植物病毒基因的作物品系（表2）。

表2 抗病類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落的影響Table 2 Influence of disease-resistant GM crops on soil microbial communities

表達(dá)具有抗菌活性的外源蛋白（如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和溶菌酶），是一種提高作物抗病能力的主要分子育種手段。幾丁質(zhì)酶可以通過(guò)分解真菌細(xì)胞壁來(lái)實(shí)現(xiàn)抗真菌的特性，但據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，表達(dá)幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非目標(biāo)和潛在有益的微生物群落并沒(méi)有產(chǎn)生不良影響。Khan等［50-51］的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因甘藍(lán)型油菜對(duì)根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)均無(wú)顯著影響，兩者間5種土壤酶活性（β-葡萄糖苷酶、脲酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶和磷酸單酯酶）也無(wú)顯著差異，但不同品種之間土壤的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。Shahmoradi等［52］通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因棉花T2代植株的根際和根區(qū)土壤微生物進(jìn)行了CFUs和PCR-DGGE分析，結(jié)果顯示，雖然根際土壤中的細(xì)菌群落會(huì)隨生育期（幼苗、花蕾、開花和鈴期）的變化而發(fā)生顯著的改變，但同一生育期轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶棉花的根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能菌數(shù)量與對(duì)照差異不顯著。此外，Bidondo等［53］和Stephan等［54］在盆栽條件下，利用RFLP技術(shù)監(jiān)測(cè)了過(guò)表達(dá)抗真菌活性肽基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對(duì)叢枝菌根真菌定殖的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯叢枝菌根真菌的定殖和共生關(guān)系與對(duì)照相比沒(méi)有顯著的差異。以上結(jié)果表明，像幾丁質(zhì)酶這些具有廣譜抗菌功能的蛋白可能并不會(huì)通過(guò)植物根系分泌至土壤中，或者說(shuō)在植物體內(nèi)表達(dá)的這些蛋白隨著植物的衰老、凋亡并不會(huì)大量的釋放到土壤環(huán)境中，因此沒(méi)有顯著改變土壤微生物的群落多樣性和結(jié)構(gòu)。

作物中導(dǎo)入一些植物病毒外殼的相關(guān)基因，如小麥黃花葉病毒（WYMV），已被證實(shí)可以顯著提高對(duì)特定植物病毒的抗性。病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位均有表達(dá)，可能會(huì)對(duì)根際土壤微生物有潛在的非靶向效應(yīng)。Wu等［55］分析了2個(gè)耕作年份轉(zhuǎn)WYMV-Nib8基因小麥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，與受體揚(yáng)麥相比，除第1年的灌漿期，其他時(shí)期（包括第2個(gè)試驗(yàn)?zāi)攴荩┺D(zhuǎn)基因小麥對(duì)土壤細(xì)菌的Shannon、Simpson和Evenness三個(gè)alpha多樣性指數(shù)的影響不顯著；除第1年苗期和第2年的成熟期外，轉(zhuǎn)基因小麥與受體根際土壤真菌群落多樣性差異也不顯著。這些結(jié)果說(shuō)明，WYMVNib8基因的導(dǎo)入并未對(duì)土壤根際微生物的群落產(chǎn)生較長(zhǎng)期的影響。Zhang等［56］采用PCR-DGGE和Biolog微生態(tài)板法研究了轉(zhuǎn)WYMV RdRp基因小麥和親本小麥的根際微生物群落，發(fā)現(xiàn)不同生育期間（苗期、莖伸長(zhǎng)期、花期和成熟期）物種相對(duì)豐度和微生物群落碳源利用能力存在明顯不同，而不同基因型間的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著差異，根際細(xì)菌多樣性主要與土壤含水量、有效磷、pH等環(huán)境因子高度相關(guān)。

2.3 抗除草劑類轉(zhuǎn)基因作物

轉(zhuǎn)抗除草劑基因作物中運(yùn)用最多的是抗草甘膦基因和抗草銨膦基因。其中，抗草甘膦基因有7種，分 別 是cp4 epsps、gat4601、goxv247、epsps、epsps grg23ace5、mepsps、2mepsps，抗草銨膦基因主要有bar和pat兩種［57-58］（表3）。

表3 抗除草劑類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落的影響Table 3 Effects of herbicide-resistant GM crops on soil microbial communities

和抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的研究結(jié)果相似，評(píng)估抗除草劑類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響研究中，也存在兩種結(jié)果。一方面，大多數(shù)結(jié)果表明作物中轉(zhuǎn)入抗除草劑基因?qū)ν寥牢⑸锶郝錄](méi)有造成特異性的影響，而主要受季節(jié)和植物發(fā)育的影響較大。Vital-Lopez等［59］通過(guò)PCR-DGGE圖譜分析，表明溫室條件下轉(zhuǎn)pat基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著。Tang等［60］采用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)抗草銨膦油菜對(duì)根際細(xì)菌群落alpha多樣性沒(méi)有較大影響，相對(duì)豐度中較高的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門，這些優(yōu)勢(shì)門在施用草銨膦的轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因受體油菜中都高度存在，但卻在油菜的不同生育期（苗期、抽薹期、開花期和成熟期）存在顯著的差異。而另一方面，也有一些研究表明，在較長(zhǎng)時(shí)間的作用下，一些轉(zhuǎn)抗除草劑基因作物會(huì)影響土壤中部分微生物的相對(duì)豐度，進(jìn)而改變微生物群落的組成。Babujia等［64］對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)10年的田間監(jiān)測(cè)，雖然抗草甘膦基因的導(dǎo)入并未對(duì)大豆的產(chǎn)量產(chǎn)生影響，但是通過(guò)宏基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)常規(guī)大豆根際土壤細(xì)菌群落中放線菌和酸桿菌豐富，而轉(zhuǎn)基因大豆則變形菌、厚壁菌和綠藻相對(duì)豐度較高，與蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞分裂周期相關(guān)的序列豐度也較高。He等［66］對(duì)成熟期細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行了Illumina MiSeq測(cè)序發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)bar基因水稻與常規(guī)水稻的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)差異不顯著，但是轉(zhuǎn)基因粳稻和常規(guī)品種之間個(gè)別屬的豐度（如綠絲菌屬）存在顯著差異，且轉(zhuǎn)基因粳稻土壤中的厭氧菌含量顯著高于常規(guī)水稻。

3 轉(zhuǎn)基因作物土壤微生物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中還應(yīng)考慮的因素

雖然上述大量的研究結(jié)果顯示作物土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)主要和環(huán)境、氣候、土壤類型、作物種類等密切相關(guān)，通過(guò)分子育種手段將外源有益基因?qū)氲阶魑镏?，從短期?lái)看并不會(huì)對(duì)土壤微生物的多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生較大的、持久的、不利的影響，但是確實(shí)也有一些證據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因事件可能會(huì)影響土壤中個(gè)別微生物種群的豐度，或者在某個(gè)特定時(shí)期影響微生物的多樣性。因此，為了能夠更加科學(xué)、準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)，我們認(rèn)為還應(yīng)當(dāng)考慮以下因素。

3.1 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在土壤中的持久性

轉(zhuǎn)基因作物在生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，往往會(huì)通過(guò)根系向土壤中釋放外源蛋白，其降解速率，或著說(shuō)殘留時(shí)間，也是影響土壤微生物群落的重要因素之一。Wang等［4］對(duì)Bt水稻土壤中Cry1Ab/1Ac蛋白的豐度和持久性等動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行了為期3年的田間監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，Bt水稻在生育期可通過(guò)根系向土壤和農(nóng)田水體中持續(xù)釋放Cry1Ab/1Ac蛋白，但是在土壤中可檢測(cè)到的Bt蛋白不會(huì)持續(xù)存在超過(guò)2個(gè)月，并且其流動(dòng)性不強(qiáng)，不會(huì)隨著灌溉水進(jìn)入相鄰的土壤。Strain等［68］的研究卻發(fā)現(xiàn)，Bt蛋白會(huì)通過(guò)地表徑流和作物殘留物被運(yùn)輸?shù)礁浇暮拥乐?，以致在非Bt玉米田中也檢測(cè)到了Cry1Ab蛋白，且沉積物類型和溫度對(duì)水中Cry1Ab蛋白的降解時(shí)間有一定的影響，最長(zhǎng)可達(dá)2個(gè)月。

3.2 標(biāo)記基因?qū)ν寥牢⑸锏挠绊?/h3>

標(biāo)記基因主要用于陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的篩選，除了目的基因，這些標(biāo)記基因也有可能會(huì)影響土壤微生物的群落，而這部分的研究報(bào)道較少。LeBlanc等［69］將CryIAb、uidA和nptII基因?qū)氚自粕贾校?duì)其根際微生物群落進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)3種基因的與僅攜帶uidA和nptII標(biāo)記基因的白云杉以及對(duì)照根際微生物物種相對(duì)豐度存在顯著差異，說(shuō)明uidA和nptII標(biāo)記基因的導(dǎo)入也會(huì)對(duì)土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響。綠色熒光蛋白（GFP）也在植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中有著廣泛的應(yīng)用。Lv等［70］發(fā)現(xiàn)，含GFP基因的煙草與對(duì)照野生型相比，在整個(gè)生育期（幼苗期、營(yíng)養(yǎng)期、花期和衰老期）對(duì)土壤微生物種群沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。因此。標(biāo)記基因?qū)ν寥牢⑸锷鷳B(tài)系統(tǒng)是否安全也存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步的研究。

3.3 田間管理對(duì)土壤微生物的影響

輪作方法，肥料、殺蟲劑和除草劑的使用等這些田間管理措施對(duì)土壤微生物也有著較大的影響。如種植轉(zhuǎn)Bt基因作物會(huì)減少殺蟲劑的使用，因此在這種情況下，還應(yīng)同時(shí)評(píng)估農(nóng)藥用量的變化對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的影響。再如，種植抗草甘膦作物的田間管理模式主要表現(xiàn)為免耕和除草劑的大量使用，這也會(huì)在一定程度上影響土壤的微生物群落［71-72］。Lupwayi等［7］用5年時(shí)間比較了抗草甘膦、抗草銨膦轉(zhuǎn)基因玉米和常規(guī)品種在除草劑噴施、不同輪作方式等條件下的土壤細(xì)菌群落。在5個(gè)耕作年中，未發(fā)現(xiàn)Bt基因轉(zhuǎn)化、殺蟲劑施用或輪作對(duì)根際土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響，但卻發(fā)現(xiàn)輪作2種Bt轉(zhuǎn)基因玉米的非根際土壤微生物總量、功能多樣性和土壤酶活性均高于1種Bt轉(zhuǎn)基因玉米單作和常規(guī)玉米輪作。

一些研究學(xué)者認(rèn)為長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)基因作物而導(dǎo)致的這些大田管理模式的變化會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的生態(tài)和農(nóng)藝問(wèn)題，包括抗除草劑雜草的蔓延、土壤的腐蝕、土壤肥力和養(yǎng)分的喪失、物種和生物多樣性的喪失等［73-74］。例如轉(zhuǎn)基因大豆單作規(guī)模的擴(kuò)大造成了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模集約化，土壤肥力下降和土壤腐蝕的加劇，也導(dǎo)致了部分土壤不能再持續(xù)利用。因此，我們?cè)陂_展轉(zhuǎn)基因作物土壤微生物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)工作中也應(yīng)該考慮這些因素。

4 展望

土壤微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的作用，外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)影響植物的新陳代謝和根系分泌物的產(chǎn)生，從而改變土壤微生態(tài)環(huán)境。因此，我們要深入開展轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。轉(zhuǎn)基因作物土壤生態(tài)系統(tǒng)安全風(fēng)險(xiǎn)的核心是要評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物的種植是否會(huì)改變土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能。研究表明，土壤微生物多樣性和功能之間沒(méi)有內(nèi)在的必然聯(lián)系，物種豐富度的改變并不會(huì)對(duì)土壤功能產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響［75-76］。目前，只有極少數(shù)研究顯示轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)對(duì)土壤微生物功能多樣性產(chǎn)生短暫的影響。如張卓等［63］利用Biolog微孔板法發(fā)現(xiàn)，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成熟期的土壤微生物碳源利用能力顯著高于受體材料，但與另一常規(guī)種植品種無(wú)顯著差異，到殘茬期三者又均無(wú)顯著性差異了。

迄今為止，已有大量的研究評(píng)估了轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物存在的潛在影響，但是由于這些研究的對(duì)象（包括外源基因和植物物種）、環(huán)境、實(shí)驗(yàn)方法等均不完全相同，所得數(shù)據(jù)也用不同的方法進(jìn)行分析，再加之大多數(shù)的研究結(jié)果都只是在1-2年的栽培期的基礎(chǔ)上得出的，因此結(jié)果必然會(huì)顯示出一定的差異。在未來(lái)的分子育種實(shí)踐中，可能還會(huì)開發(fā)出更多的多性狀疊加的轉(zhuǎn)基因作物，這會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)，研究?jī)?nèi)容也會(huì)更加復(fù)雜。正是由于當(dāng)前研究具有上述這些局限性，我們?cè)诮窈蟮墓ぷ髦校鼞?yīng)當(dāng)重視土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和功能之間相關(guān)性及其對(duì)土壤系統(tǒng)自然變化（如季節(jié)、氣候、輪作和農(nóng)藥使用）的響應(yīng)等方面的研究，從而能夠更加全面、準(zhǔn)確的評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的影響程度。

轉(zhuǎn)基因作物的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)，我們相信隨著時(shí)間的推移，人們可以更好、更全面地了解轉(zhuǎn)基因作物種植的利弊，為人類的糧食安全問(wèn)題做出貢獻(xiàn)。