劉曉藝 羊健 劉敬 王冰 戴良英 李魏

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙 410128；2. 寧波大學(xué)植物病毒學(xué)研究所，寧波 315211）

植物在生長發(fā)育過程中會受到很多逆境脅迫的影響，比如生物脅迫（害蟲、病原微生物等）和非生物脅迫（極端溫度、高鹽和干旱等）。在優(yōu)勝劣汰的自然選擇下，植物自身形成了一系列復(fù)雜有序的機制來感知和抵御環(huán)境帶來的不利影響。在植物體內(nèi)具有可以調(diào)控抵御高溫脅迫信號的重要元件，即熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factors，HSFs）［1-2］。HSFs對熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）的轉(zhuǎn)錄激活被認為在植物熱應(yīng)激的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［3］。位于脅迫響應(yīng)信號末端的HSFs能夠特異性結(jié)合高度保守的熱激元件（heat shock element，HSE），從而與其他轉(zhuǎn)錄因子聚集共同形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體以調(diào)控HSPs的表達進而調(diào)控植物對高溫脅迫的抗性［4］。此外，已有研究表明，HSFs還參與調(diào)控植物對其他非生物脅迫和生物脅迫的抗性。本文主要對水稻熱激轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與分類、功能和作用分子機制研究進展進行了綜述。

1 HSFs的典型結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，植物HSFs雖在序列大小上存在明顯差異，但都具有相似的結(jié)構(gòu)模式，包括保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化結(jié)構(gòu)域（oligomerization domain，OD）、核定位信 號（nuclear localization signal，NLS）結(jié) 構(gòu)、核輸出信號（nuclear export signal，NES）結(jié)構(gòu)以及C端激活結(jié)構(gòu)域（C-transcriptional activation domain，CTAD）5個部分［5］。

1.1 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）

高度結(jié)構(gòu)化的DBD結(jié)構(gòu)域是HSFs中最保守的區(qū)域，靠近HSFs的N端，約由100個氨基酸組成，含有3個α-螺旋和4個β-折疊形成一個疏水核心［6］。并且DBD的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（H2-T-H3）結(jié)構(gòu)具有分解代謝激活蛋白的的特征［7］，能夠精準定位并特異性識別同樣高度保守的HSE的保守基序，從而進一步激活靶標基因的轉(zhuǎn)錄及表達［8］。

1.2 寡聚化結(jié)構(gòu)域（OD）

HSFs都含有1個OD結(jié)構(gòu)，OD的氨基酸序列含有2個疏水七肽重復(fù)區(qū)域A和B（HR-A/B）。每個重復(fù)區(qū)域形成1個以亮氨酸拉鏈為特征的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，植物遭受熱激脅迫時，HSFs通過該卷曲螺旋結(jié)構(gòu)形成同源三聚體，促使HSFs與其靶標的HSE結(jié)構(gòu)結(jié)合調(diào)控?zé)峒っ{迫響應(yīng)［9］。其中，OD結(jié)構(gòu)是判定HSFs家族成員分類的重要依據(jù)［10］。根據(jù)序列的相似性和OD的結(jié)構(gòu)特性，可以將植物HSFs劃分為進化保守的A、B、C三大類。植物B類HSFs的HR-A/B結(jié)構(gòu)區(qū)域緊湊，在HR-A與HR-B之間沒有氨基酸殘基插入，而植物A類HSFs和C類HSFs的HR-A和HR-B區(qū)域間分別插入了21個和7個氨基酸而得到了擴展［11］。

1.3 核定位信號（NLS）和核輸出信號（NES）結(jié)構(gòu)域

NLS結(jié)構(gòu)與OD結(jié)構(gòu)的C端相鄰，由一簇富集賴氨酸和精氨酸的堿性氨基酸殘基組成，與HSFs亞細胞定位和進入細胞核有關(guān)。有些HSFs的C末端還具有富含亮氨酸的NES結(jié)構(gòu)，與植物細胞內(nèi)的蛋白向核外輸出密切相關(guān)。NLS與NES協(xié)同作用可以控制HSFs在細胞核及細胞質(zhì)中的自由分布［12］。

1.4 C端激活結(jié)構(gòu)域（CTAD）

CTAD是HSFs序列上最不保守的區(qū)域，含有由芳香族氨基酸殘基（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）、大的疏水性氨基酸殘基（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）和酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）組成的短 肽AHA（aromatics，hydrophobic and acidic amino acid residues）基序［11］。AHA基序與一些基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，是HSFs進行轉(zhuǎn)錄激活時所必需的條件，而只有A類HSFs具有AHA基序。因此，通常認為只有A類HSFs具有轉(zhuǎn)錄激活功能，B、C兩類HSFs則不具有轉(zhuǎn)錄激活功能［13］。

1.5 水稻體內(nèi)HSFs的分類

水稻HSFs的組成和功能具有多樣性（表1），這或許是水稻適應(yīng)自然環(huán)境導(dǎo)致的進化結(jié)果。

表1 水稻HSFs的分類與生物學(xué)功能Table 1 Classification and biological functions of rice HSFs

2 OsHSFs在水稻抗非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能與機制

水稻在其生命周期中會遇到很多的非生物脅迫，常見的包括極端溫度脅迫、干旱脅迫、高鹽脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫等。大量研究表明，水稻HSFs在調(diào)控植物抗非生物脅迫的功能中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。

2.1 HSFs在水稻抗溫度脅迫中的功能與應(yīng)用

高溫脅迫是水稻生長發(fā)育過程中常見的環(huán)境脅迫因子，會導(dǎo)致水稻的減產(chǎn)甚至顆粒無收。高溫脅迫一般通過破壞水稻體內(nèi)細胞膜結(jié)構(gòu)、影響酶的活性以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來影響細胞的功能，從而導(dǎo)致水稻體內(nèi)的代謝紊亂甚至是大量累積有害物質(zhì)，情況嚴重時甚至?xí)?dǎo)致水稻死亡［11］。為減少高溫脅迫帶來的危害，水稻需要一系列功能基因和蛋白的參與來適應(yīng)環(huán)境，其中就包括HSFs［32］。楊雙蕾［17］通過對水稻OsHsfA2e過表達轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系進行熱處理，測量它們的莖葉生理指標發(fā)現(xiàn)，過表達株系體內(nèi)的H2O2含量，SOD活性以及POD活性的升高速度比野生型快；而葉綠素的降低速度比野生型的要慢，并且始終維持在一個較高的水平。并且根據(jù)熱處理之后的表型分析發(fā)現(xiàn)，野生型株系的萎蔫情況特別嚴重，而過表達株系莖葉的生長情況比野生型株系要健壯且基本不發(fā)生萎蔫，說明OsHsfA2e能夠提高水稻的耐熱性。此外，研究發(fā)現(xiàn)OsHsfA2d能夠編碼2種剪接變體蛋白OsHsfA2dI和OsHsfA2dII，在正常條件下，OsHsfA2dII是顯性但轉(zhuǎn)錄無活性的剪接形式；當(dāng)植物遭受高溫脅迫時，OsHsfA2d剪接成轉(zhuǎn)錄活性形式OsHsfA2dI，進而參與熱應(yīng)激反應(yīng)以提高水稻植株的耐熱性［16］。

Mittal等［24］與Chauhan等［18］對水稻植株進行4℃低溫脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，A類HSFs基因OsHsfA3、OsHsfA4d、OsHsfA7和OsHsfA9，B類HSFs基 因Os-HsfB4b以及C類HSFs基因的表達量都顯著上調(diào)。其中OsHsfC1b受低溫誘導(dǎo)超強表達，作為主要的低溫感受元件存在。這些結(jié)果說明HSFs在水稻抵御低溫脅迫的信號中也發(fā)揮著重要作用。此外，冉靜［27］發(fā)現(xiàn)，對水稻OsHsfB2b過表達和RNAi轉(zhuǎn)基因植株幼苗進行5℃低溫脅迫處理2周后，OsHsfB2b-RNAi及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖克劳觯鳲sHsfB2b過表達植株仍有13%的存活率，表明OsHsfB2b基因的過表達可以提高水稻對低溫脅迫的耐受性。

2.2 OsHSFs在水稻抗干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能與機制

在自然條件下，干旱脅迫往往與高溫脅迫同時發(fā)生。干旱脅迫對植物造成的生理影響表現(xiàn)在氣孔關(guān)閉，光合作用和呼吸作用減弱等方面，在分子生物學(xué)水平上則表現(xiàn)為HSPs的積累。并且植物在應(yīng)對干旱脅迫時會產(chǎn)生一種重要的化合物，即肌醇半乳糖苷合成酶（GolS1）。研究發(fā)現(xiàn)，植物HSFs可能通過介導(dǎo)目的基因GolS1的表達來參與植物干旱脅迫應(yīng)答機制，此外還能作用于下游干旱相應(yīng)元件結(jié)合因子DREB2A和DREB2C，提高部分干旱脅迫響應(yīng)基因的表達［33］。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過觀測OsHsfA7過表達植株和野生型植株斷水處理10 d后復(fù)水10 d的表型，野生型植株進一步枯萎而OsHsfA7過表達植株中的一部分恢復(fù)了正常的生長［22］。OsHsfB2b是水稻B類HSFs的成員，可模擬干旱信號的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理對OsHsfB2b表達有強烈的誘導(dǎo)作用，OsHsfB2b過表達植株的耐旱性顯著降低，而OsHsfB2b-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性增強。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻OsHsfB2b的相對電導(dǎo)率（relative electrical conductivity，REC）和丙二醇（malondialdehyde，MDA）含量增加，脯氨酸含量下降，而OsHsfB2b-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的REC和MDA含量降低，脯氨酸含量增加［23］。過表達OsHsfB2b能夠降低水稻種子萌發(fā)期的耐旱性，且OsHsfB2b過表達會降低水稻對干旱脅迫的耐受性，表明OsHsfB2b負調(diào)控水稻的耐旱性［27］。由此可見，OsHSFs通過不同的作用機制參與水稻對干旱脅迫的調(diào)控。

2.3 OsHSFs在水稻抗其他非生物脅迫中的功能與機制

鹽堿化的土地會嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子能夠增強作物的耐鹽性［34］。據(jù)報道，HSFs同樣可以介導(dǎo)水稻的耐鹽性。水稻體內(nèi) 的OsHsfA2a、OsHsfA2b、OsHsfA2c、OsHsfA2d、OsHsfA2e、OsHsfA4b、OsHsfA5、OsHsfA7、OsHsfA9、OsHsfC1b等基因在高鹽脅迫下都能被誘導(dǎo)表達，從而能提高植物的抗高鹽脅迫能力［15，31］。此外，上文提及的OsHsfB2b-OX轉(zhuǎn)基因水稻種子在高鹽處理下的苗高和萌發(fā)率均低于對照［27］；并且OsHsfB2b過表達轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性顯著降低，而OsHsfB2b-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性增強［23］，表明OsHsfB2b蛋白負調(diào)控水稻的耐鹽性。

氧化脅迫是高溫、高鹽等逆境引起的二級脅迫，引起水稻體內(nèi)ROS的大量積累，對細胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸造成損傷，導(dǎo)致細胞的代謝功能降低甚至細胞死亡［15］。已有報道表明，氧化脅迫會引起水稻體內(nèi)多個OsHSFs轉(zhuǎn)錄表達增強［35］。Mittal等［14］發(fā)現(xiàn)OsHsfA2a、OsHsfB4b和OsHsfC2a是ROS積累和感知途徑中的主要參與者，并且提出在所有OsHSFs中，OsHsfA2a在氧化應(yīng)激的兩個時間點（即1 h和4 h）表達最高，而OsHsfA2f和OsHsfA7可能參與氧化應(yīng)激的后期反應(yīng)。此外，用ABA和H2O2處理水稻后，OsHsfA4a和OsHsfA2基因的表達均上調(diào)，分別在4 h處理時間內(nèi)產(chǎn)生2個表達高峰；又通過H2O2清除劑和抑制劑預(yù)處理試驗證明，ABA對水稻HSFs基因的誘導(dǎo)作用是通過ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2來實現(xiàn)的［19］。由于OsHsfA2在干旱和活性氧脅迫下表達量均升高，說明OsHSFA家族和水稻的抗氧化脅迫行為密切相關(guān)。

農(nóng)業(yè)土壤的鎘污染已造成一些糧食作物和蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的下降，影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［36］，因此植物耐鎘性的分子調(diào)控具有重要意義。Shim等［20］對小麥基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA4a參與調(diào)控植物對鎘的耐受性。水稻體內(nèi)與TaHsfA4a同源性最高的OsHsfA4a蛋白也同樣能夠在酵母系統(tǒng)中提高對鎘的耐受性，但同源性第二高的OsHsfA4d沒有此功能。相應(yīng)地，異源表達TaHsfA4a的水稻植株對鎘的耐受性增強，而OsHsfA4a基因被敲除的水稻植株對鎘的耐受性降低。對利用TaHsfA4a和OsHsfA4d構(gòu)建的嵌合蛋白進行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明HsfA4a的DBD對于鎘耐受性起關(guān)鍵作用，而在DBD內(nèi)，Ala-31和Leu-42位點對于鎘耐受性是非常重要的［20］。此外，TaHsfA4a介導(dǎo)的鎘抗性需要金屬硫蛋白（metallothionein，MT），在小麥和水稻的根部，鎘脅迫引起HsfA4a和MT基因的轉(zhuǎn)錄水平提高。因此該研究結(jié)果表明，小麥和水稻的HsfA4a通過上調(diào)MT基因表達來提高植物的鎘耐受性。

3 OsHSFs在水稻抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能與機制

3.1 OsHSFs在水稻抗稻瘟病中的功能與機制

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病發(fā)病于水稻的各個生育期，是水稻生產(chǎn)上的毀滅性病害，在世界各水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生［37］。防治稻瘟病最經(jīng)濟、有效的方法就是培育抗病水稻品種。N-乙酰殼寡糖（GNn）作為病原物相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），在水稻中被模式識別受體CEBiP［38］和OsCERK1［39］感知。一旦與受體結(jié)合，GNn會激發(fā)一系列植物免疫反應(yīng)，包括基因表達變化、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、ROS積累等［40］。水稻GRAS家族蛋白CIGR2是1個GNn信號應(yīng)答基因，其活性通過OsHsf23直接轉(zhuǎn)錄控制，在病原物感染期間介導(dǎo)過敏性細胞死亡的激活。CIGR2以及OsHsf23的RNAi轉(zhuǎn)基因植株的葉鞘表皮細胞在接種稻瘟菌無毒菌株后表現(xiàn)出高度顆?；?，而這兩種轉(zhuǎn)基因植株的抗性并未發(fā)生改變，這表明CIGR2可能通過激活OsHsf23以抑制稻瘟病菌引起的不親和互作中水稻細胞過度死亡［30］。

3.2 OsHSFs在水稻抗白葉枯病中的功能與機制

由 黃 單 胞 菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的重要細菌性病害。白葉枯病是Xoo通過水孔或傷口進入水稻葉片，入侵維管組織而引起的［41］。水稻抗病品種‘SH5’和感病品種‘8411’接種Xoo 6 h后，OsHsfA2s、OsHsfB2s 和OsHsfC2b等11個HSFs成 員在抗、感品種‘SH5’和‘8411’中的表達水平存在顯著差異［42］。而有研究分析了7個OsHSFs基因（OsHsfA2a、OsHsfA2c、OsHsfA2d、OsHsfB2a、OsHsfB2b、OsHsfB2c1和OsHsfB2c2）在水稻葉片接種Xoo小種P6后的表達情況，發(fā)現(xiàn)僅OsHsfB2c2參與了水稻對白葉枯病的抗性［29］。由此可見，HSFs成員在水稻對白葉枯病的防御過程中發(fā)揮重要作用。此外，有報道表明OsHsfB4d通過與OsHsp18.0-CI的啟動子結(jié)合進而調(diào)控對白葉枯病的抗性［28］。

3.3 OsHSFs在水稻抗細菌性條斑病中的功能與機制

由另一黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）引起的細菌性條斑病是影響全球水稻生產(chǎn)的重要病害之一［43］。Xoc通過傷口或氣孔入侵水稻，定殖于水稻葉片的薄壁組織細胞間并擴展形成條狀病斑，隨著病斑的不斷擴大，會導(dǎo)致水稻葉片的枯死。在水稻上接種Xoc菌株RS105后發(fā)現(xiàn)可以上調(diào)熱激轉(zhuǎn)錄因子OsHsp18.0-CI的表達［44］。過表達OsHsp18.0-CI的轉(zhuǎn)基因水稻明顯增強對Xoc菌株RS105的抗性，而OsHsp18.0-CI表達受抑制的水稻株系對RS105菌株的抗性則相應(yīng)降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA-seq，與野生型水稻相比，基礎(chǔ)防御相關(guān)基因的表達在OsHsp18.0-CI過表達水稻植株中明顯增強。接種RS105菌株后，這些抗病基因的表達在OsHsp18.0-CI過表達水稻植株中相較于野生型對照植株更強烈地激活［45］。由此發(fā)現(xiàn)OsHsp18.0-CI正調(diào)節(jié)水稻對細菌性條斑病的抗性。除此之外，用Xoc菌株RS105在中華11（野生型，ZH11）和過表達OsHsp18.0-CI的水稻中接種后OsHsfB4d均上調(diào)。并且過表達OsHsfB4d的水稻植株對RS105抗性增強，OsHsp18.0-CI和致病相關(guān)基因表達增加。此外OsHsfB4d直接與OsHsp18.0-CI啟動子中攜帶唯一HSE的DNA片段結(jié)合［28］，這表明OsHsfB4d參與了水稻對細菌性條斑病的防御過程。

3.4 OsHSFs在水稻葉片假病斑中的功能與機制

植物類突變體是指在沒有明顯機械損傷、病原物侵染或者逆境脅迫的情況下，植物組織在葉片、葉鞘等部位自發(fā)形成類似病原物侵染和壞死斑的一類突變體［46］。許多水稻斑點葉突變體是了解水稻抗稻瘟病、抗白葉枯病和細胞程序性死亡機制的理想來源［47］。水稻類病變突變發(fā)生的原因比較復(fù)雜，除了受內(nèi)部基因的調(diào)控之外，光照、溫度和濕度等環(huán)境因素也會導(dǎo)致一些類病變突變體壞死斑的形成［21］。通過測序分析和互補實驗發(fā)現(xiàn)，斑點葉基因spl7編碼OsHsfA4d［48］。在高溫及光照條件下，突變體spl7從分蘗到抽穗，整個葉片表面均分布著相對較小的紅棕色小點［21，48］，而當(dāng)降低溫度，或遮去光照中的紫外線，葉片斑點癥狀均會減輕。但是，無論是高溫或紫外線處理，突變體spl7在幼苗和嫩葉中沒有發(fā)現(xiàn)任何損傷［48］，這表明OsHsfA4d負調(diào)控光溫下水稻的細胞死亡，在抑制水稻葉片假斑病中起到作用。

4 OsHSFs在水稻體內(nèi)的其他功能

除了參與水稻對各種脅迫的應(yīng)答之外，OsHSFs還參與了調(diào)控水稻的生長發(fā)育過程。例如通過比較OsHsfA7過表達植株和野生型植株的根系不同，發(fā)現(xiàn)OsHsfA7過表達水稻的側(cè)根和根毛在苗期短于野生型對照植株，但是OsHsfA7過表達水稻的主根比野生型對照植株更長，說明OsHsfA7在水稻根的生長過程中起重要作用［22］。通過對OsHsf18轉(zhuǎn)基因水稻植株進行農(nóng)藝性狀調(diào)查之后發(fā)現(xiàn)，OsHsf18過表達植株與野生型對照植株相比，植株變矮，分蘗數(shù)減少，結(jié)實率降低，千粒重下降［45］。OsHsf18-RNAi轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比，雖然在株高和分蘗數(shù)上無明顯差異，但是結(jié)實率低，千粒重下降［25-26］。說明OsHSF18參與調(diào)控水稻的農(nóng)藝性狀，其轉(zhuǎn)錄水平過高或過低對植株的生長發(fā)育都有一定的影響。

5 小結(jié)與展望

自從植物HSFs被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控植物應(yīng)對高溫脅迫開始，人們對其結(jié)構(gòu)和功能機制有了更深入的研究，并且發(fā)現(xiàn)HSFs還參與調(diào)控植物對其他非生物脅迫和生物脅迫的抗性。該文綜述了HSFs的典型結(jié)構(gòu)，以及水稻HSFs的相關(guān)研究進展，發(fā)現(xiàn)HSFs參與水稻對溫度、鹽堿度、濕度、病害等多種非生物和生物逆境的響應(yīng)。但縱觀近年的研究進展，發(fā)現(xiàn)對水稻HSFs的研究主要以高溫脅迫為主，且多為對單一脅迫的影響，而對其在病蟲害生物脅迫方面的功能研究甚少。

由于對HSFs的功能研究目前還不夠全面，可以從以下幾方面展開進一步研究：（1）運用基因敲除、基因突變、超表達和RNAi等技術(shù)對HSFs在水稻病蟲害生物脅迫響應(yīng)中的作用機理展開深入研究。（2）運用CHIP-Seq技術(shù)鑒定HSFs蛋白在全基因組上的結(jié)合位點，通過挑選不同通路中的差異性表達基因進行更深入的研究，了解其與HSFs的分子互作機理。（3）應(yīng)用基因工程和分子育種技術(shù)，將能提高響應(yīng)逆境脅迫的HSFs應(yīng)用到水稻育種中，提高水稻的產(chǎn)量、對病原物的抗性和對非生物脅迫的耐受性。進一步闡明HSFs在不同類型的非生物脅迫與生物脅迫中的功能和信號途徑，有利于解析和完善植物抗病抗逆分子機制，并對水稻乃至其他作物抗病、抗逆育種中充分利用HSFs提高植物對逆境脅迫的耐受能力具有重要意義。