劉貞，鄭雙雙，鐘振華，夏紅英，熊欣，程奇珍

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

藥物與包裝材料之間的相容性，直接關(guān)系到藥品的安全性和有效性，是藥品行業(yè)亟待深入了解和研究的內(nèi)容［1-2］。注射劑給藥后直接進入循環(huán)系統(tǒng)或組織，屬于與包裝系統(tǒng)發(fā)生相互作用可能性較高的高風險制劑［3-4］。

注射用鹽酸吉西他濱是凍干制品，其包裝材料主要為硼硅玻璃管制注射劑瓶和藥用鹵化丁基橡膠塞。藥用鹵化丁基橡膠塞在生產(chǎn)過程中，通常會加入硫化劑、硫化促進劑、抗氧劑、填充劑、防焦劑、著色劑、活性劑等添加物［5-7］。當藥物與膠塞接觸時，膠塞中的這些化學成分有可能緩慢地遷移至藥物中，影響藥品的穩(wěn)定性和安全性。在諸多添加物中，抗氧劑較為常見。目前廣泛使用的抗氧劑主要分為酚類、酯類等，酚類抗氧劑常作為主抗氧劑，而硫代酯類和亞磷酸酯類抗氧劑常作為輔助抗氧劑［8-11］。酚類抗氧劑主要包含抗氧劑BHT、抗氧劑3114、抗氧劑1010、抗氧劑1076、抗氧劑1330 等?？寡鮿?68 是亞磷酸酯類常用抗氧劑。本試驗主要考察膠塞中常用抗氧劑BHT、1310、3114、1010、1330、1076、168 在注射用鹽酸吉西他濱中的遷移。

1 儀器和試劑試藥

Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀，Mettler toledo MS105 型電子天平，Memmert HPP749 恒溫恒濕實驗箱，VELP Scientifica Vortex WX 渦旋混合器。

抗氧劑1310（批號D5GJF-SL）、抗氧劑BHT（批號VLMAF-NM，含量99.0%）、抗氧劑3114（批號ROX6O-FJ，含量98.0%）、抗氧劑1330（批號P6WVJ-AA，含量95.0%）、抗氧劑1076（批號WECNC-BL，含量98.0%）、抗氧劑168（批號EJ6HG-GE，含量98.0%），均購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；抗氧劑1010（批號C10271799，含量94%）購自上海麥克林生化科技有限公司。甲醇（色譜純，sigma-aldrich），二氯甲烷（色譜純，Anaqua chemicals supply）。溶劑：二氯甲烷-甲醇（1∶1）。

注射用鹽酸吉西他濱12 批次：A 公司190211（規(guī)格：0.2 g）、190115（規(guī)格：1.0 g），B 公司AA1D7005A（規(guī)格：0.2 g）、AA2D8005A（規(guī)格：1.0 g），C 公司E1811012（規(guī)格：0.2 g），D 公司090181201（規(guī)格：0.2 g），E 公司190107（規(guī)格：0.2 g）、190218（規(guī)格：1.0 g），F(xiàn)公司181025（規(guī)格：0.2 g）、180326（規(guī)格：1.0 g），G公司201901012（規(guī)格：0.2 g），H 公司20180704（規(guī)格：0.2 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），柱溫35 ℃；以甲醇為流動相A、1%醋酸為流動相B，梯度洗脫（0～8 min,85%→100% A；8～36 min，100% A；36～39 min，100% →85% A；39～50 min，85% A），流速1.0 mL/min；檢測波長277 nm；進樣體積20 μL。

2.2 溶液的制備

取抗氧劑1310、BHT、3114、1010、1330、1076、168 各適量，精密稱定，分別加二氯甲烷溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含1 mg 的溶液，作為各對照品貯備液。精密量取抗氧劑1310、1076 貯備液各2 mL，抗氧劑BHT 貯備液1 mL，抗氧劑3114、1010、1330、168 貯備液各5 mL，至50 mL 量 瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液S0。用溶劑定量稀釋制成不同濃度的對照品溶液S1～S10。

取注射用鹽酸吉西他濱，將藥粉混合均勻，取藥粉約0.4 g，精密稱定，至10 mL 比色管中，精密加入溶劑5 mL，渦旋（2 000 rpm）1 min，靜置，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性

取混合對照品溶液S2、供試品溶液、溶劑分別進樣。結(jié)果表明（圖1～3）溶劑對測定無干擾，各抗氧劑峰與相鄰峰均能完全分離。

圖1 混合對照品溶液的HPLC圖

圖2 供試品溶液的HPLC圖

圖3 溶劑的HPLC圖

2.4 線性和范圍

取混合對照品溶液S1～S7 進樣，以峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。7 種抗氧劑在相應濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，見表1。

表1 抗氧劑線性和范圍（BHT：n=7，其他：n=6）

2.5 回收率試驗和重復性試驗

取注射用鹽酸吉西他濱（F 公司，批號190120，規(guī)格0.2 g），照“2.2”項下制備供試品溶液，供試品本底溶液中未檢出各待測抗氧劑。

取混合均勻的注射用鹽酸吉西他濱（F 公司，批號190120，規(guī)格0.2 g）藥粉約0.4 g，精密稱定，至10 mL 比色管中，分別精密加入混合對照品溶液S2 0.8、1.0、1.2 mL，再分別精密加入溶劑4.2、4.0、3.8 mL，渦旋（2 000 r/min）1 min，靜置，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為加樣回收溶液，低、中、高每個濃度水平平行制備3 份，同時考察方法的回收率和重復性?？寡鮿?310、BHT、3114、1010、1330、1076、168 的平均回收率分別為89.7%、97.3%、98.4%、98.8%、98.9%、93.6%、97.6%，RSD分別為1.9%、1.3%、0.6%、0.7%、0.7%、1.7%、1.0%。

2.6 進樣精密度和溶液穩(wěn)定性

取混合對照品溶液S4 進樣6 次，抗氧劑1310、BHT、3114、1010、1330、1076、168 峰面積的RSD分別為1.4%、1.5%、0.5%、0.9%、0.7%、1.4%、0.6%。

取“2.5”項下中濃度水平回收溶液分別在0、5、10、15、20、25 h 記錄色譜圖，抗氧劑1310、BHT、3114、1010、1330、1076、168 峰 面 積 的RSD 分別為1.5%、1.6%、1.4%、0.9%、1.0%、1.9%、0.5%，說明各抗氧劑在25 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 檢測限和定量限

取混合對照品溶液S5～S10 分別進樣，測得各抗氧劑檢測限、定量限見表2。

表2 抗氧劑AET計算結(jié)果

2.8 供試品的測定

取注射用鹽酸吉西他濱分別正置、倒置于溫度40℃±2℃，相對濕度75%±5%的恒溫恒濕箱中進行加速試驗，于第3 個月月末取出，照“2.2”項下制備供試品溶液。同時測定對應的未加速供試品。另取對應批次的室溫保存（0 月）膠塞，洗凈晾干，剪碎，混合均勻，取約1 g，精密稱定，至25 mL比色管中，精密加入溶劑10 mL，超聲30 min，放冷至室溫，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為膠塞提取溶液。

測定結(jié)果顯示，所有企業(yè)膠塞中共檢出了四種抗氧劑：抗氧劑1310 的檢出量分別為23.5 μg/g（B 公司，規(guī)格0.2 g）、25.9 μg/g（B 公司，規(guī)格1.0 g）、13.4 μg/g（C 公 司，規(guī) 格0.2 g）、7.0 μg/g（D 公 司，規(guī)格0.2 g）、12.1 μg/g（E 公司，規(guī)格0.2 g）、14.5 μg/g（E 公司，規(guī)格1.0 g）、15.6 μg/g（F 公司，規(guī)格0.2 g）、21.3 μg/g（F 公司，規(guī)格1.0 g），抗氧劑BHT 的檢出量分別為56.7 μg/g（D 公司，規(guī)格0.2 g）、122.0 μg/g（F 公司，規(guī)格1.0 g）、105.2 μg/g（G 公司，規(guī)格0.2 g），抗氧劑1010 的檢出量分別為22.1 μg/g（A公司，規(guī)格0.2 g）、17.9 μg/g（A 公司，規(guī)格1.0 g）、77.7 μg/g（C 公司，規(guī)格0.2 g）、22.7 μg/g（H 公司，規(guī)格0.2 g），抗氧劑1076 的檢出量分別為91.8 μg/g（B公司，規(guī)格0.2 g）、189.9 μg/g（B 公司，規(guī)格1.0 g）、355.5 μg/g（E 公司，規(guī)格0.2 g）、516.8 μg/g（E 公司，規(guī)格1.0 g）、489.3 μg/g（G 公司，規(guī)格0.2 g）。

鹽酸吉西他濱藥粉中只有D 公司0.2 g 規(guī)格和F公司1.0 g規(guī)格共2個批次檢出了抗氧劑BHT，圖4，所有批次藥粉中均未檢出其他抗氧劑。

圖4 加速試驗抗氧劑BHT檢出情況

3 討論

抗氧劑3114、1010、1330、1076、168 的推薦日允許最大暴露量（permitted daily exposure，PDE）分別為25、10、5、0.3、2.5 mg/d。抗氧劑1310 為抗氧劑1010 和1076 潛在的降解產(chǎn)物，參考兩個前體PDE值較低者進行安全性評估，因此抗氧劑1310 的PDE值采用0.3 mg/d［12］?？寡鮿〣HT 的每日口服最大允許攝入量為0.125 mg/kg［13］。參考ICH Q3D，在無口服生物利用度數(shù)據(jù)或職業(yè)暴露限度的情況下，以口服PDE 值除以校正因子100 計算注射PDE 的推算值。成年人體重以50 kg 計，抗氧劑BHT 注射PDE=0.125 mg·kg-1·d-1×50 kg/100=0.062 5 mg/d。另外需對產(chǎn)品的分析評價閾值（analytical evaluation threshold,AET）進行計算［3,14］。表2 顯示所建立分析方法的靈敏度能夠滿足各抗氧劑AET 值低濃度水平的測定需要。

抗氧劑1310、1010、1076 遷移至鹽酸吉西他濱藥粉中的可能性很低；而藥粉中檢出了抗氧劑BHT 對應批次的膠塞中亦檢出了抗氧劑BHT，推測藥粉中的抗氧劑BHT 可能是由膠塞遷移引入的。圖4 顯示加速3 月的藥粉中抗氧劑BHT 的檢出量相對于室溫保存（0 月）的藥粉中檢出量有所下降，推測可能是在加速試驗條件下抗氧劑BHT 發(fā)生了一定程度的降解；加速3 月倒置藥粉中抗氧劑BHT的檢出量比加速3 月正置藥粉中檢出量高，這為抗氧劑BHT 的遷移提供了進一步的證據(jù)。2 個批次藥粉中抗氧劑BHT 的檢出量均低于其AET 值，見圖5，可認為由抗氧劑BHT 遷移導致的安全性風險小。

圖5 注射用鹽酸吉西他濱藥粉中抗氧劑BHT檢出情況

綜上所述，本試驗建立的分析方法可用于測定注射用鹽酸吉西他濱藥粉中抗氧劑1310、3114、1010、1330、1076、168 和BHT 的遷移量。根據(jù)測定結(jié)果均未檢出抗氧劑1310、3114、1010、1330、1076、168 的遷移；抗氧劑BHT 可能會遷移至藥粉中，但遷移量很少，藥粉中抗氧劑BHT 的檢出量低于AET 值，對該藥品的安全性影響小。