張捷， 何軍， 熊浪， 陳道慧， 彭寧， 黎婷婷， 任真奎,2， 禹文峰， 吳昌學(xué)

(1.貴州省第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)是一種好發(fā)于中老年人的癡呆性疾病，其病理表現(xiàn)為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集形成的老年斑塊(senile plaque，SP)、細(xì)胞內(nèi)高磷酸化的tau蛋白組成神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)(intracellular neurofibrillary tangles，NFTs)、神經(jīng)元壞死或功能失活及突觸受損等[1-2]。已知AD的病理機(jī)制有大腦神經(jīng)元Aβ的異常聚集、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和自噬功能失調(diào)等[3-4]。隨著對(duì)AD發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，科學(xué)家提出有效抑制大腦內(nèi)Aβ的異常聚集，可能是治療AD的一個(gè)有效靶點(diǎn)[5-6]，但其療效也一直存在爭議。因此，尋找有效的小分子化合物或藥物調(diào)控清除腦內(nèi)Aβ寡聚體對(duì)AD的治療具有一定的意義。PNU是α7煙堿型乙酰膽堿受體的激動(dòng)劑，研究認(rèn)為PNU在AD的動(dòng)物模型、急性肺損傷模型及LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型等皆有保護(hù)作用，但是其確切的分子機(jī)制尚不清楚[7-8]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PNU能夠激活PI3K / Akt / mTOR自噬信號(hào)通路，且伴隨著Aβ水平的降低[9]。Seipin是一個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多次跨膜蛋白，對(duì)脂滴的形態(tài)具有重要調(diào)控作用[10-11]，其突變導(dǎo)致2型先天脂肪營養(yǎng)不良；Seipin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，在AD和缺血性腦卒中細(xì)胞、動(dòng)物模型中均有研究報(bào)道[12]。研究發(fā)現(xiàn)Seipin可以調(diào)控細(xì)胞的自噬水平，并在Seipin N88S / S90L突變體轉(zhuǎn)基因小鼠中亦檢測到自噬的激活，突變體細(xì)胞內(nèi)免疫熒光顯示自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)的亞細(xì)胞位置與突變的Seipin蛋白高度重疊[13-14]，提示Seipin與自噬存在聯(lián)系。因此，本研究擬用Aβ處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞(簡稱BV2細(xì)胞)模型探討PNU對(duì)BV2細(xì)胞Seipin蛋白表達(dá)、自噬功能，并探討分析二者之間相互調(diào)控的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

BV2細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫，PNU282987和Aβ藥物購自Sigma公司，LC3和Beclin-1抗體購自美國CST公司，Aβ抗體購自Gentex公司，Seipin抗體購自美國Abcam公司。Seipin shRNA慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因生物公司，RNAi靶序列為GTAGAACTCTACTCTGACTAT，陰性對(duì)照插入序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2 研究方法

1.2.1BV2細(xì)胞的培養(yǎng) 將購買的BV2細(xì)胞凍存管放入之前預(yù)熱好的37 ℃恒溫水浴鍋中融化，避免慢融；將管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含完全培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min；丟棄上清液，再加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，之后接種于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞較散在地鋪于培養(yǎng)瓶底面，培養(yǎng)瓶置于5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；根據(jù)鏡下細(xì)胞狀態(tài)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2CCK8法篩選Aβ最適造模濃度 Aβ作為誘導(dǎo)AD體外模型的藥物，用CCK-8法檢測不同濃度Aβ(0、0.1、1、5、10及30 μmol/L)對(duì)BV2細(xì)胞的損傷作用，參照實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)所使用的方法篩選Aβ最適濃度，處理24 h。

1.2.3病毒感染實(shí)驗(yàn) 用Seipin shRNA慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒感染BV2細(xì)胞，參照實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)所使用的方法，培養(yǎng)觀察細(xì)胞熒光，獲得陰性對(duì)照細(xì)胞與Seipin低表達(dá)細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞分組 根據(jù)1.2.2獲得的造模濃度，將細(xì)胞分為正常組(未做任何處理)和Aβ組(Aβ孵育24 h)，采用Western Blot檢測Aβ處理24 h細(xì)胞的Seipin蛋白表達(dá)水平。為了探索PNU對(duì)Aβ的抑制作用，將細(xì)胞分組為Aβ組(Aβ處理24 h)和Aβ+PNU組(5 μmol/L PNU處理細(xì)胞18 h、再加入Aβ孵育24 h)，觀察Aβ的表達(dá)情況；為了探索PNU對(duì)Seipin及自噬的影響，設(shè)置正常組(未做任何處理)與PNU組(5 μmol/L PNU處理細(xì)胞18 h)，觀察Seipin以及LC3和Beclin-1的表達(dá)情況；為了驗(yàn)證慢病毒對(duì)Seipin的敲低效果，設(shè)置陰性對(duì)照組(非靶向性慢病毒)和si-Seipin組(靶向Seipin 的siRNA慢病毒)，用Western blot檢測Seipin表達(dá)水平；為了探索Seipin在PNU激活自噬及抑制Aβ過程中的重要性，設(shè)置陰性對(duì)照+Aβ組、陰性對(duì)照+Aβ+PNU組、si-Seipin+Aβ+PNU組，采用Western blot檢測Aβ和LC3的表達(dá)水平。

1.2.5Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平 將上述各組細(xì)胞提取的蛋白樣品與適量5×Buffer混勻，沸水變性10 min，室溫冷卻備用；用12% SDS-PAGE凝膠以40 mA電流進(jìn)行電泳，PVDF膜在冰浴中轉(zhuǎn)膜2 h，封閉液室溫封閉1 h, TBST洗滌2次，5 min/次；將實(shí)驗(yàn)所用一抗4 ℃孵育過夜，之后TBST洗滌3次，5 min/次；再以相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，10 min/次，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色。用曝光儀獲取圖像結(jié)果，并用ImageJ計(jì)算灰度值，總蛋白以β-actin 為內(nèi)部參照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK8法篩選Aβ最適造模濃度

用不同濃度的Aβ處理BV2細(xì)胞，CCK8結(jié)果顯示：隨著Aβ濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。與0 μmol/L相比，細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L的Aβ處理后其細(xì)胞存活率顯著下降30%；而在其他濃度下細(xì)胞受損較輕或較嚴(yán)重，均不適于誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型來進(jìn)行相關(guān)研究觀察。因此，選擇濃度為10 μmol/L Aβ作為建模濃度(圖1)。

注：與0 μmol/L比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 不同濃度Aβ處理的細(xì)胞存活率Fig.1 The survival rate of cells treated with different concentrations of Aβ

2.2 Aβ處理后BV2細(xì)胞中Seipin蛋白水平

在Aβ誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞模型檢測Seipin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)Aβ處理后BV2細(xì)胞中Seipin蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常組比較， P<0.05。圖2 各組BV2細(xì)胞中Seipin蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of Seipin in each group

2.3 Aβ作用BV2細(xì)胞經(jīng)PNU處理后Aβ表達(dá)

為了驗(yàn)證PNU能抑制Aβ表達(dá)，BV2細(xì)胞經(jīng)PNU處理18 h后，再用Aβ處理24 h；結(jié)果顯示，與Aβ組比較，PNU能夠減少Aβ的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 BV2細(xì)胞經(jīng)PNU處理后Seipin表達(dá)

為了探索PNU對(duì)Seipin表達(dá)的影響，在BV2細(xì)胞中加入PNU處理。結(jié)果顯示，與正常組比較，PUN組BV2細(xì)胞中Seipin蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與Aβ組比較， P<0.05。圖3 PNU處理后各組BV2細(xì)胞Aβ蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of Aβ treated by PNU in each group

注：(1)與正常組比較，P<0.05。圖4 PNU處理后各組BV2細(xì)胞中Seipin蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of Seipin treated by PNU in each group

2.5 BV2細(xì)胞經(jīng)PNU處理后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，與正常組比較，PNU組BV2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與正常組比較， P<0.05。圖5 PNU處理后各組BV2細(xì)胞中LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)Fig.5 The expression of LC3 and Beclin-1 treated by PNU in each group

2.6 Seipin低表達(dá)細(xì)胞的鑒定

為了探索si-Seipin慢病毒對(duì)Seipin表達(dá)的影響，BV2細(xì)胞經(jīng)si-Seipin慢病毒處理后，檢測到Seipin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖6。

注：(1)與NC組比較， P<0.05。圖6 si-Seipin慢病毒對(duì)BV2細(xì)胞中Seipin表達(dá)的影響Fig.6 The effect of si-Seipin lentivirus on Seipin expression

2.7 低表達(dá)Seipin后LC3和Aβ的表達(dá)

結(jié)果顯示，與NC+Aβ組相比較，NC+Aβ+PNU組BV2細(xì)胞中Aβ明顯降低、LC3-Ⅱ明顯升高(P<0.01)；與NC+Aβ+PNU組比較，si-Seipin-Aβ+PNU組BV2細(xì)胞中Aβ明顯升高、LC3-Ⅱ明顯降低(P<0.01)。見圖7。

3 討論

癡呆類神經(jīng)退行性疾病的特征是神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性損害，例如導(dǎo)致認(rèn)知能力下降的脆弱神經(jīng)元群體的選擇性喪失。盡管每年都有報(bào)道全世界有數(shù)以百萬計(jì)的人受到影響，但仍然沒有藥物能夠阻止該疾病的過程或減慢疾病的進(jìn)展。AD患者的神經(jīng)元死亡與大腦內(nèi)聚集的錯(cuò)誤折疊蛋白Aβ有關(guān)[15-17]。機(jī)體有兩種主要的降解途徑——泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑，可以清除細(xì)胞中不需要的或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，以防止其積累并維持細(xì)胞的功能[18-19]。隨著年齡的增長，蛋白酶體的降解和自噬功能顯著降低，因此，腦內(nèi)大量的、具有神經(jīng)毒性的Aβ和tau蛋白聚集體異常蓄積[20]。自噬是AD病理機(jī)制中研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，PNU作為其常用的研究藥物，也發(fā)現(xiàn)與自噬的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，但是其具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚[21]。近年來，Seipin蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究越來越多，被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)一些功能密切相關(guān)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的調(diào)控[22]。其次，報(bào)道也提出Seipin與自噬調(diào)控有關(guān)，此外，小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)駐留的免疫細(xì)胞，具有吞噬、清除腦內(nèi)異常代謝廢物或蓄積物質(zhì)的功能[23-24]。探討PNU增強(qiáng)BV2細(xì)胞自噬途徑介導(dǎo)Aβ寡聚體的清除機(jī)制，對(duì)AD的有效治療具有重要意義。

注：(1)與NC+Aβ+PNU組比較，P<0.01；(2)與NC+Aβ組比較，P<0.01。圖7 各處理組Aβ和LC3蛋白表達(dá)水平Fig.7 The expression of Aβ and LC3 in each group

本研究中，BV2細(xì)胞用濃度為10 μmol/L的Aβ寡聚體處理構(gòu)建AD細(xì)胞模型。經(jīng)Aβ造模后細(xì)胞Seipin蛋白水平下降，在病理狀態(tài)下Seipin蛋白表達(dá)降低，提示Aβ抑制了BV細(xì)胞Seipin蛋白的表達(dá)。PNU處理能夠使細(xì)胞內(nèi)Aβ蛋白減少，證明PNU通過降低Aβ發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。以上結(jié)果與之前研究報(bào)道一致[9]。為了闡明PNU的作用機(jī)制，在單獨(dú)加PNU處理的情況下，Seipin蛋白增加，自噬蛋白LC3和Beclin-1也增加。與之前PNU處理后能改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，Aβ聚集形成的斑塊減少，并發(fā)現(xiàn)了自噬溶酶體的存在，及Beclin-1表達(dá)增加的研究結(jié)果具有一致性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Seipin蛋白水平在PNU的處理下能夠上調(diào)，且在Aβ單獨(dú)處理下Seipin蛋白水平降低，此外，PNU能促進(jìn)Aβ的降解，據(jù)此，推測PNU發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能是上調(diào)Seipin蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)Seipin蛋白介導(dǎo)的自噬并降解Aβ寡聚體。為了進(jìn)一步論證以上猜測，本研究進(jìn)一步對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)敲低Seipin蛋白，再將該細(xì)胞與未干擾的細(xì)胞均進(jìn)行Aβ和PNU處理，結(jié)果顯示Seipin缺少后與正常細(xì)胞相比其Aβ升高，LC3-Ⅱ降低，提示PNU的保護(hù)效應(yīng)一定程度上依賴于Seipin的存在。

綜上所述，Aβ處理BV2細(xì)胞后Seipin降低，PNU能夠抑制Aβ的表達(dá)，PNU上調(diào)Seipin增強(qiáng)自噬降解Aβ是該效應(yīng)的可能機(jī)制。