王迪， 黃勁， 姚昌昊， 王梅竹， 程敏， 郭鑫瑤， 廖萬清， 康穎倩,7***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省微生物與人類健康關(guān)系研究人才基地 & 貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025; 5.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 皮膚科， 上海 200003； 6.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200003; 7.貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴州 貴陽 550009)

隨著人類對真菌學(xué)認(rèn)識的發(fā)展，真菌對人類健康的影響越來越明顯[1]。由于免疫缺陷宿主數(shù)量的增加和抗真菌耐藥性的增加，真菌感染已成為醫(yī)院的重要問題，其死亡率和治療的經(jīng)濟(jì)成本不斷上升[2]。在真菌種類中，念珠菌是真菌病最常見的原因，其中白念珠菌(Candidaalbicans)由于較強(qiáng)的黏附能力比其他念珠菌更容易被發(fā)現(xiàn)[3]。如今，白念珠菌被認(rèn)為是人類的主要真菌病原體，它是一種常見于口腔、腸道及陰道黏膜健康菌群中的真菌，是最常見的真菌感染之一[4-6]，其感染可能是表面感染或全身感染，在免疫功能低下的患者中尤為常見， 在這些患者的發(fā)病率和死亡率均很高[7-8]。除了由于持續(xù)或嚴(yán)重念珠菌感染而導(dǎo)致的疾病外，據(jù)報(bào)道越來越多的疾病也顯示出與念珠菌感染有關(guān)[9-10]。因此，白念珠菌在促進(jìn)急性或慢性感染過程中的作用值得考慮，尤其是在其分泌由菌絲特異性基因(hypha-specific gene，ECE1)編碼的毒素Candidalysin的情況下[11]。白念珠菌本身具有不同的形態(tài)，能在酵母、假菌絲及菌絲狀態(tài)間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，其發(fā)病機(jī)理特征之一就是菌絲態(tài)的產(chǎn)生，Candidalysin就是首個從人類真菌病原體中分離出來的溶細(xì)胞肽毒素[12]。白念珠菌ECE1基因編碼的菌絲特異性蛋白是激活宿主表皮細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)所必需的[13]，其中Candidalysin是念珠菌菌絲在侵襲過程中分泌，它能夠不斷積累并攻擊宿主細(xì)胞膜，可以誘導(dǎo)p38-絲裂原活化蛋白激酶/C-Fos的激活和絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen activated protein kinase phosphatase 1，MKP1)的磷酸化信號，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，直接驅(qū)動上皮損傷、激活上皮免疫和吞噬細(xì)胞吸引[13-14]；這種毒素在真菌感染期間觸發(fā)先天抗真菌免疫中起著重要作用，是白念珠菌黏膜感染至關(guān)重要的菌絲毒力因子[15-16]，但ECE1基因及Candidalysin在白念珠菌全身感染中的作用有待進(jìn)一步探索。鑒于白念珠菌作為威脅生命的真菌病原體的重要性，本研究擬利用白念珠菌感染Balb/c小鼠的慢性感染模型來研究白念珠菌菌株及各種遺傳突變株中ECE1基因和Candidalysin對白念珠菌培養(yǎng)特性及致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1白念珠菌實(shí)驗(yàn)菌株ece1Δ/Δ菌株(ECE1基因敲除菌株)、ece1Δ/Δ+ECE1菌株(ECE1基因敲除回補(bǔ)菌株)、BWP17菌株(CiP30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的親本菌株)及M2174菌株(Candidalysin毒素敲除菌株)，所有實(shí)驗(yàn)菌株均由英國倫敦國王學(xué)院Julian R.Naglik教授贈送。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 4～6周齡無特定病原體級(specific pathogen free，SPF)Balb/c雌性小鼠70只，體質(zhì)量18～20 g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(黔)2018-0001]；實(shí)驗(yàn)開始前1周將小鼠飼養(yǎng)于小鼠籠具，自由進(jìn)食和飲水，以利于適應(yīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

1.1.3主要試劑和儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud’s glucose agar，SDA)及念珠菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉CHROMagar)，10%牛血清白蛋白、Spider培養(yǎng)基、甲醛、氯化鈉、葡萄糖、三丁酸甘油酯瓊脂基礎(chǔ)及三丁酸甘油酯(北京索萊寶)，引物(上海生工生物)；微量可調(diào)加樣器(法國Gilson)，超低溫冰箱(日本SANYO)，手提式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅)，數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱(杭州藍(lán)天儀器)，生物安全柜(青島海爾)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)，紫外分光光度計(jì)(上海元析)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種復(fù)蘇及菌液制備 將選取的ece1Δ/Δ菌株、ece1Δ/Δ+ECE1菌株、BWP17菌株、M2174菌株復(fù)蘇解凍后傳于SDA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征。挑取SDA培養(yǎng)基中各菌株的單個菌落，轉(zhuǎn)接至CHROMagar Candida培養(yǎng)基及50 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 h觀察；利用紫外分光光度計(jì)用生理鹽水(Saline)將菌液濃度調(diào)整至2×108CFU/L，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2胞外水解酶活力檢測 制備牛血清白蛋白平板[17]、卵黃瓊脂平板[18]及三丁酸甘油酯平板[19]，將菌株接種至平板上并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)5 d，觀察各平板上菌落的沉淀圈或透明圈；以Pz值[Pz=菌落直徑/(菌落直徑+圈層直徑)]表示水解酶的表達(dá)水平，并測量菌落直徑和菌落加圈層的總直徑，Pz值≤0.59表示水解酶高表達(dá)，0.60≤Pz值≤0.79表示水解酶中等表達(dá)，0.80≤Pz值<1.00表示水解酶低表達(dá)，Pz值=1表示不產(chǎn)此水解酶[20-21]。

1.2.3菌絲誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 挑取“1.2.1”項(xiàng)下復(fù)蘇培養(yǎng)的白念珠菌單個菌落重懸于Spider液體培養(yǎng)基中，并用紫外分光光度計(jì)調(diào)整菌懸液濃度至1×109個/L，加12 孔板、1 mL/孔，37 ℃培養(yǎng)3 h，于倒置顯微鏡下觀察拍照；高倍鏡下選取3個不同的視野，計(jì)數(shù)100個孢子中形成菌絲相的孢子數(shù)[22]。

1.2.4實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)記及分組 取70只實(shí)驗(yàn)小鼠用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記，隨機(jī)雙盲法均分為BWP17組、ece1Δ/Δ組、ece1Δ/Δ+ECE1組、M2174組及Saline(陰性對照)組，14只/組，將“1.2.1”項(xiàng)下已經(jīng)配制好濃度為2×108CFU/L的菌液和生理鹽水通過側(cè)尾靜脈注射入Balb/c小鼠體內(nèi)，注射0.2 mL/只，正常飼養(yǎng)。

1.2.5小鼠體質(zhì)量、死亡情況及病理學(xué)特征評價(jià) 觀察注射后30 d內(nèi)各組Balb/c小鼠的體質(zhì)量變化；觀察注射后90 d內(nèi)的各組小鼠死亡情況，對各組死亡小鼠及Saline組斷頸處死小鼠采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織制作切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色( hematoxylin-eosin staining，HE)，鏡下觀察其病理學(xué)特征[23]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 菌落特征

白念珠菌菌株及各種遺傳突變株在SDA培養(yǎng)基上的菌落特征無明顯差異，均表現(xiàn)為菌落較大，直徑約1～2 mm，光滑濕潤，呈奶油狀圓形分布；感染小鼠的各組白念珠菌在CHROMagar Candida培養(yǎng)基上的菌落顏色顯示為淺綠色到深綠色，ece1Δ/Δ+ECE1菌株菌落為深綠色，BWP17菌株和ece1Δ/Δ菌株的菌落為中等綠色，M2174菌株的菌落為淺綠色。見圖1。

ece1Δ/Δ菌株 ece1Δ/Δ+ECE1菌株 BWP17菌株 M2174菌株圖1 各組白念珠菌在CHROMagar Candida培養(yǎng)基上的菌落特征(肉眼觀)Fig.1 Colony characteristics of C. albicans in CHROMagar Candida culture medium(naked-eye view)

2.2 胞外水解酶檢測

胞外水解酶檢測結(jié)果表明，除M2174菌株外，白念珠菌其余菌株體外培養(yǎng)第5天水解酶均為蛋白酶(secreted aspartyl proteinase，SAP)活力陽性、高表達(dá)，且表現(xiàn)為ece1Δ/ΔECE1菌株、BWP17菌株SAP的Pz值分別低于ece1Δ/Δ菌株(P<0.05)；4種白念珠菌菌株均表現(xiàn)為磷脂酶(phospholipase，PL)活力陽性、高表達(dá)，脂肪酶(lipase，Lip)活力陰性，但各組間PL和Lip的Pz值比較、差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各種白念珠菌SAP、PL及Lip活力Tab.1 SAP, PL, and Lip activities of C. albicans strains in different groups

2.3 菌絲形成能力

4種白念珠菌菌株的菌絲形成能力不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；菌絲形成能力最強(qiáng)的是ece1Δ/Δ+ECE1菌株，其次為BWP17菌株和M2174菌株，最弱的是ece1Δ/Δ菌株。見表2和圖2。

表2 各種白念珠菌菌株的菌絲形成能力Tab.2 Hyphal formation ability of C. albicans

ece1Δ/Δ菌株 ece1Δ/Δ+ECE1菌株 BWP17菌株 M2174菌株注：白色箭頭所示為白念珠菌菌絲體。圖2 Spider液體培養(yǎng)基中各種白念珠菌的菌絲生長情況(光鏡，×400)Fig.2 Mycelia growths of C. albicans in Spider liquid culture medium(light microscopy,×400)

2.4 小鼠體質(zhì)量變化

BWP17組、ece1Δ/Δ+ECE1組在菌液注射感染24 d后小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)小幅緩慢回升，Saline組的小鼠30 d內(nèi)的體質(zhì)量一直在增加；第7、14、21及28天各觀察時間點(diǎn)內(nèi)各菌株感染組與Saline組相比，體質(zhì)量均有降低(P<0.05)。見表3。

表3 感染后30 d內(nèi)各組小鼠的體質(zhì)量變化Tab.3 Changes of body mass in 30 days in mice infected with C. albicans from different groups

2.5 生存曲線

各組小鼠感染白念珠菌后第5天陸續(xù)出現(xiàn)死亡，第28天時死亡率為21.43%～57.14%，第90天時死亡率為78.57%～100.00%；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)顯示各組小鼠生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

圖3 各組小鼠白念珠菌感染后90 d內(nèi)的生存曲線Fig.3 Survival curves covering 90 d after mice were infected with C. albicans in different groups

2.6 病理學(xué)特征

HE染色結(jié)果顯示，ece1Δ/Δ組、ece1Δ/Δ+ECE1組、BWP17組及M2174組小鼠心臟、肺臟及脾臟未見明顯異常，肝臟呈慢性炎癥表現(xiàn)、局部肝血竇有輕微擴(kuò)張充血；ece1Δ/Δ組小鼠腎實(shí)質(zhì)為慢性炎癥表現(xiàn)、腎盂見大量真菌菌絲，ece1Δ/Δ+ECE1組小鼠腎實(shí)質(zhì)見大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)可見出血，M2174組小鼠腎臟見大量炎癥細(xì)胞浸潤、部分腎小球崩解、局部間質(zhì)內(nèi)出血、腎盂內(nèi)見大量中性粒細(xì)胞浸潤，BWP17組小鼠腎實(shí)質(zhì)慢性炎癥、局部腎小球崩解、部分腎小管內(nèi)可見膿腫。見圖4。

Saline組 ece1Δ/Δ組 ece1Δ/Δ+ECE1組 BWP17組 M2174組圖4 各組小鼠腎臟組織的HE染色結(jié)果(400×)Fig.4 HE staining results of mouse kidney tissue in different groups(400×)

3 討論

在白念珠菌的毒力因子中，酵母相到菌絲相的形態(tài)轉(zhuǎn)化是非常重要的一種，菌絲體為造成該生物體毒力的主要因素之一，無菌絲相的白念珠菌突變體是沒有毒力的[4]。轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)的白念珠菌則更易侵襲宿主組織，從而獲取更為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，Candidalysin就是最近新發(fā)現(xiàn)的這樣一種白念珠菌肽毒素[1]。它可以促進(jìn)真菌獲取營養(yǎng)物質(zhì)，并侵入深部組織，已成為關(guān)鍵的菌絲相關(guān)毒力決定因素[1]。本研究中通過菌絲形成能力的檢測也發(fā)現(xiàn)ece1Δ/Δ+ECE1基因敲除回補(bǔ)菌株的菌絲形成能力最強(qiáng)，缺乏編碼Candidalysin肽毒素的ECE1基因的突變ece1Δ/Δ菌株在一般情況下毒性較低，相對應(yīng)的ece1Δ/Δ基因敲除菌株的菌絲形成能力則最弱，感染小鼠的白念珠菌菌株及各種遺傳突變株的菌絲形成能力之間存在著明顯差異。

白念珠菌為適應(yīng)宿主的環(huán)境條件，演化出了多種機(jī)制，其中包括了白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變、分泌胞外水解酶等，分泌型水解酶是白念珠菌重要的致病因素，分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶及脂肪酶等能夠介導(dǎo)白念珠菌入侵宿主，并逃避宿主抗真菌的感染免疫，在白念珠菌致病中起了關(guān)鍵作用[24-25]。本研究表明，感染小鼠的各白念珠菌菌株及各種遺傳突變株之間胞外水解酶活力存在不同程度的差異，ece1Δ/Δ+ECE1組和BWP17組菌株蛋白酶活力強(qiáng)，但M2174組菌株蛋白酶活力為陰性，說明Candidalysin分泌的缺失影響了白念珠菌蛋白酶的活力表達(dá)，白念珠菌內(nèi)源基因ECE1的存在對白念珠菌胞外水解酶的表達(dá)也發(fā)揮了正向促進(jìn)作用。本研究采用尾靜脈感染是血源性感染的方式，磷脂酶作為血源性感染的重要毒力因子，實(shí)驗(yàn)中4組白念珠菌血源性感染的磷脂酶表達(dá)也都為高表達(dá)，同時胞外水解酶活力的表達(dá)水平差異也引起了感染小鼠的差異性死亡。

利用小鼠尾靜脈注射的方式感染Balb/c小鼠，在實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠在感染后體質(zhì)量大多出現(xiàn)了不同程度的下降，此時處于真菌的急性感染期，加之采用了尾靜脈注射的有創(chuàng)操作，影響了小鼠的生長狀態(tài)；后期小鼠體質(zhì)量緩慢回升,說明白念珠菌感染激活了小鼠自身的免疫系統(tǒng)，進(jìn)入了慢性感染階段，體質(zhì)量有所回升。在白念珠菌系統(tǒng)感染小鼠后，感染3 d后小鼠就出現(xiàn)了死亡情況，有創(chuàng)操作恢復(fù)不良引起了小鼠死亡，1周后小鼠繼續(xù)死亡，白念珠菌的急性感染發(fā)揮了作用。在感染過程中BWP17野生菌株組、ece1Δ/Δ+ECE1基因敲除回補(bǔ)菌株組小鼠體質(zhì)量下降較快，但ece1Δ/Δ基因敲除菌株組的小鼠體質(zhì)量仍在緩慢上升，直至15 d以后才出現(xiàn)緩慢下降。研究發(fā)現(xiàn)隨著病程的進(jìn)展，4種不同組別白念珠菌死亡率從高到低依次為ece1Δ/Δ+ECE1基因敲除回補(bǔ)菌株組、M2174基因敲除菌株組、BWP17野生菌株組、ece1Δ/Δ基因敲除菌株組。由于ECE1基因是白念珠菌菌絲生長或質(zhì)膜完整性所必需的，是上皮損傷和菌絲發(fā)育之間的“關(guān)鍵環(huán)節(jié)”[4]。ece1Δ/Δ菌株作為ECE1基因敲除菌株，影響了白念珠菌的菌絲發(fā)育，而在小鼠系統(tǒng)性感染中，菌絲形成缺陷的白念珠菌突變體，其毒力減弱，小鼠死亡率降低，說明ECE1基因及編碼的Candidalysin增強(qiáng)了白念珠菌對小鼠的致病能力。ECE1基因編碼一個含271個氨基酸的前體蛋白，該蛋白可以被Kex8p酶切割成8個較小的肽(ece1-Ⅰ～ece1-Ⅶ)，Candidalysin就是由其前體蛋白通過真菌酶促處理而產(chǎn)生并從菌絲中分泌的Ece1-Ⅲ活性肽[1]。M2174菌株作為Candidalysin肽毒素敲除菌株，除不產(chǎn)生Candidalysin外，其他7個較小的肽依舊可以產(chǎn)生[15]，說明在白念珠菌感染小鼠過程中，除Candidalysin發(fā)揮了毒力作用以外，另外的7種相關(guān)分泌肽同樣也有相應(yīng)的協(xié)同毒力作用。

腎臟作為白念珠菌系統(tǒng)性感染動物模型的靶器官，在本研究中各組小鼠腎臟的病變情況最為明顯，腎盂、腎盞擴(kuò)張，內(nèi)見大量白念珠菌菌絲，其他心肝脾肺等病變情況較輕，主要都是以引起感染器官的慢性炎癥為主。白念珠菌菌株及各種遺傳突變株引起的慢性炎癥考慮與Candidalysin在感染過程中可以誘導(dǎo)許多炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，如白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)/β、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及IL-17等；在真菌毒素的作用下，IL-1α/β、IL-6及IL-17等發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)促炎信號，建立前饋激活環(huán)，加重了感染的嚴(yán)重性，最終促進(jìn)了宿主對小鼠和人類的真菌炎癥反應(yīng)[26-27]。

綜上，白念珠菌雖然對于環(huán)境具有高度的適應(yīng)能力，但在白念珠菌感染小鼠過程中，ECE1基因及編碼的Candidalysin肽毒素發(fā)揮了重要的毒力作用。通過了解宿主與白念珠菌之間潛在的病原或防御相互作用機(jī)制，可以更好地探討在病原體感染過程中發(fā)揮重要因素的毒力因子[28]。一旦揭示了潛在的分子機(jī)制，就有可能開發(fā)出各種治療策略，以防止由白念珠菌感染引起的組織損傷和死亡。