王迪， 黃勁， 姚昌昊， 王梅竹， 程敏， 郭鑫瑤， 廖萬清， 康穎倩,7***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省微生物與人類健康關(guān)系研究人才基地 & 貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025; 5.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 皮膚科， 上海 200003； 6.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點實驗室， 上海 200003; 7.貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴州 貴陽 550009)

侵襲性真菌感染是指2個或2個以上的器官或組織受到真菌侵犯所引起的感染性疾病，占所有真菌感染性疾病的90%以上，包括念珠菌病、隱球菌病和毛孢子菌病在內(nèi)的多種嚴(yán)重真菌病[1]。艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者或接受抗癌治療、血液干細(xì)胞替換及器官移植的患者是侵襲性真菌感染的高危人群，特別是對于有潛在的嚴(yán)重疾病如糖尿病、血液病及放化療、服用免疫抑制藥物及留置醫(yī)療設(shè)備患者，由于破壞了先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而為機(jī)會性病原體的感染創(chuàng)造了機(jī)會，使得侵襲性真菌感染的發(fā)病率顯著增加[2-6]。由于侵襲性真菌感染通常情況下累及多個器官，加之全新的、有效的抗真菌藥物的缺乏及對侵襲性真菌感染的臨床認(rèn)識缺乏等原因，侵襲性真菌感染的死亡率一直居高不下，已成為西方國家乃至全世界發(fā)病和死亡的重要原因[7]。動物模型是研究多種感染性疾病發(fā)病機(jī)理的有力工具，可以模擬宿主的免疫干擾和人類真菌病的組織特異性特征，并且可以避開一些倫理問題直接研究病原體對動物體內(nèi)組織或器官的作用，具有體外試驗不可比擬的優(yōu)勢[8-11]，其中小鼠模型因其成本低、易于處理、技術(shù)可行性以及其豐富使用經(jīng)驗而特別受到關(guān)注[12]。同時，侵襲性真菌的靜脈感染具有良好的特征性和可重復(fù)性，酵母可迅速傳播到整個宿主體內(nèi)，已經(jīng)成為目前最為常用的構(gòu)建動物模型的感染途徑[13]。本研究通過選擇臨床發(fā)病率最高的侵襲性酵母菌白念珠菌、新生隱球菌分別感染不同品系的小鼠，從動物品系選擇、劑量選擇及模型評價等多個方面對侵襲性酵母感染小鼠模型建立過程進(jìn)行逐一描述及研究，力求獲得穩(wěn)定可靠的侵襲性真菌感染動物研究模型，為真菌發(fā)病機(jī)理、定量毒力、分析抗真菌藥物功效真菌疫苗開發(fā)以及侵襲性真菌感染的治療等各方面研究提供最基礎(chǔ)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 白念珠菌菌株ATCC10231T(白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株)、GYWu27菌株(臨床AIDS病人來源)、GYF76菌株[臨床外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)病人來源]及N110菌株(健康人來源)，新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H99T菌株。所用實驗菌株均由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供，實驗菌株經(jīng)過生理生化等鑒定。

1.1.2實驗動物 4～6 周齡無特定病原體級(specific pathogen free，SPF)Balb/c小鼠80只，4～6 周齡SPF級昆明(kunming，KM)小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(黔)2018-0001]。

1.1.3主要試劑與儀器 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud agar medium，SDA；美國BD)，高壓蒸汽滅菌器(日本Tomy Kogyo Co.Lid)，制冰機(jī)(日本SANYO)，Thermo 17R小型臺式高速離心機(jī)和HH-B11恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))。

1.2 實驗方法

1.2.1菌液配制 復(fù)蘇原代保存菌種，解凍后分別傳于SDA、YPD培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h；挑取單個菌落傳代于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使白念珠菌、新生隱球菌處于對數(shù)生長期，將培養(yǎng)物離心洗滌2次，重懸于無菌鹽水中，通過分光光度法及細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整菌液濃度至所需濃度[14]。

1.2.2篩選侵襲性真菌感染的最適濃度 所有小鼠先進(jìn)行一周適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持溫度22～26 ℃、濕度50%～70%、光照12 h明暗交替環(huán)境條件，自由進(jìn)水進(jìn)食，待一般狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行實驗；分別取KM小鼠和Balb/c小鼠各30只，隨機(jī)均分為5組、每組6只，注射濃度分別為1×106、1×107、1×108、1×109及1×1010CFU/L白念珠菌ATCC10231T菌株，觀察14 d內(nèi)小鼠的死亡速率、確定侵襲性真菌感染的最適濃度。

1.2.3實驗分組與造模 分別取KM小鼠和Balb/c小鼠各50只，均用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記，并按照隨機(jī)雙盲法分為GYWu27組、GYF76組、N110組、H99T組、生理鹽水(Saline)組，每組KM小鼠和Balb/c小鼠各10只。采用1 mL注射器吸取配制好的“1.2.2”項下篩選的最適菌液濃度，經(jīng)各組小鼠側(cè)尾靜脈注射感染實驗小鼠。注射當(dāng)日稱量每只小鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量確定接種劑量，按照0.1 mL菌液/10 g小鼠[15-16]；Saline組小鼠根據(jù)0.1 mL Saline/10 g小鼠注射生理鹽水。

1.2.4一般狀態(tài)、體質(zhì)量及生存情況 觀察各組小鼠注射菌液或生理鹽水后30 d內(nèi)的一般狀態(tài)和體質(zhì)量，同時記錄90 d內(nèi)的生存狀況。

1.2.5靶器官載菌量檢測 對死亡的GYWu27組、GYF76組、N110組、H99T組小鼠及定期分批處死的Saline組小鼠進(jìn)行解剖，采集GYWu27組、GYF76組、N110組、Saline組小鼠的腎臟，采集H99T組、Saline組小鼠的腦組織，分別加含0.05%氯霉素的PBS緩沖液1 mL，用微型組織細(xì)胞破碎儀勻漿；組織勻漿后，按適當(dāng)比例進(jìn)行稀釋，將稀釋后液體接種到含0.05%氯霉素SDA平板中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)真菌菌落數(shù)。

1.2.6分離菌株鑒定 取“1.2.5”項下采集到的小鼠腎臟、腦組織勻漿液，分別涂布于SDA、YPD一次性平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h；如培養(yǎng)結(jié)果陽性，重新鑒定菌株。

1.2.7病理組織學(xué)檢測 對死亡GYWu27組、GYF76組、N110組及H99T組小鼠進(jìn)行解剖，采集GYWu27組、GYF76組、N110組KM小鼠和Balb/c小鼠的腎臟、肝臟，采集H99T組KM小鼠和Balb/c小鼠的腎臟、肝臟、腦組織，10%多聚甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 侵襲性真菌感染最適濃度的篩選

結(jié)果表明，1×106和1×107CFU/L ATCC10231T組KM小鼠和Balb/c小鼠感染至第14天時均無死亡，觀察周期延長至30 d仍未見死亡；1×1010CFU/L ATCC10231T組Balb/c小鼠組感染第1天即開始死亡，1×1010CFU/L ATCC10231T組KM小鼠感染第2天出現(xiàn)死亡，至第14天時2種品系小鼠均全部死亡。綜合表1中各菌液濃度的小鼠死亡情況，侵襲性真菌感染動物模型Balb/c小鼠ATCC10231T最適感染濃度為1×108CFU/L，KM小鼠ATCC10231T最適感染濃度為1×109CFU/L。

表1 不同濃度ATCC10231T感染KM小鼠和Balb/c小鼠后不同時間的死亡情況[n(%)]Tab.1 Death of KM mice and Balb/c mice infected with ATCC10231T at different concentrations at different times[n(%)]

2.2 一般狀態(tài)和體質(zhì)量變化

注射菌液第1天各處理組KM小鼠和Balb/c小鼠的狀態(tài)良好，被毛光滑柔順，活動狀態(tài)良好；注射第3天，小鼠表現(xiàn)為安靜少動、消瘦、飲食量下降、皮毛欠光滑等現(xiàn)象，GYWu27組、GYF76組、N110組、H99T組小鼠開始出現(xiàn)嗜睡、皮膚黏膜青紫、站立不穩(wěn)、行動明顯遲緩等表現(xiàn)；感染第20天，H99T組Balb/c小鼠一般狀態(tài)不斷變差，被毛不光滑，食欲下降，呈現(xiàn)瀕死狀態(tài)。感染第4天，GYWu27組、GYF76組、N110組、H99T組KM小鼠和Balb/c小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，感染第7天均下降；至感染20～24 d，小鼠體質(zhì)量再次緩慢回升；Saline組兩種系小鼠的體質(zhì)量則一直不斷增加；GYWu27組、GYF76組、N110組及H99T組兩種系小鼠同時點體質(zhì)量分別與Saline組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 白念珠菌和新生隱球菌感染后 KM和Balb/c小鼠的體質(zhì)量變化Tab.2 Changes of body weight in KM mice and Balb/c mice infected with C. albicans and C. neoformans

2.3 生存情況

生存情況結(jié)果顯示，Saline組KM和Balb/c小鼠均無死亡；對于KM小鼠，GYWu27組小鼠70 d內(nèi)全部死亡，GYF76組小鼠80 d內(nèi)全部死亡，N110組90 d生存率20%，H99T組小鼠46 d內(nèi)全部死亡；對于Balb/c小鼠，GYWu27組、GYF76組、N110組、H99T組比較，log-rank檢驗結(jié)果顯示各組小鼠生存曲線間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。因此可認(rèn)為不同真菌感染對不同品系小鼠生存情況有影響。

圖1 白念珠菌和新生隱球菌感染KM小鼠和Balb/c小鼠的生存曲線Fig.1 Survival curves of KM mice and Balb/c mice infected with C. albicans and C. neoformans from different sources

2.4 GYF76和H99T組小鼠分離菌株的鑒定

GYF76和H99T組小鼠分離菌株的鑒定結(jié)果顯示，GYF76組體外及KM小鼠感染分離菌株在SDA培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，可見白色圓形酵母樣菌落生長、表面光滑濕潤，CHRO Margar培養(yǎng)基上分離前后菌株均呈中等綠色；H99T組體外及Balb/c小鼠感染分離菌株在YPD培養(yǎng)基上為乳白色酵母型菌落，感染前后分離菌株墨汁染色鏡下均呈圓形或橢圓形，外周有寬厚的莢膜，折光性強(qiáng)不易著色。見圖2和圖3。

圖2 白念珠菌GYF76感染KM小鼠前、后分離菌株的菌落特征(肉眼觀)Fig.2 Colony characteristics of GYF76 strain isolated before and after infection of KM mice(naked eye view)

2.5 靶器官菌種負(fù)荷

Saline組KM及Balb/c小鼠的腎臟、腦組織全程未分離培養(yǎng)出菌株，GYWu27組、GYF76組、N110組KM及Balb/c小鼠腎臟皆檢測出白念珠菌；N110組Balb/c小鼠的真菌負(fù)荷量高于KM小鼠(P<0.05)，但其他各組小鼠間靶器官菌種負(fù)荷量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；H99T組KM及Balb/c小鼠腦組織也檢測出新生隱球菌。見圖4。

2.6 病理組織學(xué)

H99T菌株感染后，不同品系小鼠腎臟均有大量炎癥細(xì)胞浸潤，腦組織腦實質(zhì)透明變性、局部皮層下見真菌感染灶、炎癥細(xì)胞浸潤及大量出血壞死，肝臟組織見部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、中央靜脈及匯管區(qū)周邊可見大量真菌聚集、炎癥細(xì)胞浸潤以及纖維化形成、肝血竇可見陳舊性出血(圖5)；GYF76菌株感染后，不同品系小鼠腎臟均表現(xiàn)為慢性炎癥、以大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)為主的炎性細(xì)胞浸潤、部分腎小球壞死、腎盂見大量真菌，肝組織肝中央靜脈及匯管區(qū)等境界清楚、肝血竇適度充血、局部脂肪變性及大部分組織無明顯異常(圖6)。提示H99T菌株和GYF76菌株感染后KM小鼠和Balb/c小鼠兩種不同品系小鼠的腎臟、腦組織、肝臟組織病理變化特征基本相同。

注：箭頭所示為真菌感染灶。圖5 新生隱球菌H99T感染后KM小鼠和Balb/c小鼠腎臟、腦組織及肝臟組織的病理學(xué)特征(HE，×400)Fig.5 Pathological changes in internal organs of the mice infected with C. neoformans H99T(HE,×400)

圖6 GYF76菌株感染KM小鼠和Balb/c小鼠腎臟、肝臟組織的病理學(xué)特征(HE，×400)Fig.6 Pathological changes in internal organs of the mice infected with C. albicans GYF76 (HE，×400)

3 討論

根據(jù)真菌感染部位的不同，可分為淺表真菌感染模型和深部真菌感染模型，多臟器感染時又被稱為侵襲性真菌感染模型[17-20]?，F(xiàn)有真菌物種中約300種可導(dǎo)致人類疾病，但是因真菌病導(dǎo)致死亡的病例中最常見病原體是念珠菌、曲霉菌及隱球菌[21-23]。所以，本研究采用了占首位的白念珠菌及隱球菌病的主要病原體新生隱球菌為主要研究對象。有研究已證明小鼠與人類疾病過程和宿主免疫反應(yīng)的相似性，因此小鼠這類嚙齒類動物是研究念珠菌和隱球菌發(fā)病機(jī)理的理想選擇[24-25]。其實，影響動物模型構(gòu)建過程中感染易感性的因素不僅包括小鼠品系，還包括接種菌株、接種物濃度及接種方法等[26]。人類在出生后不久就被白念珠菌定殖，念珠菌病最常見是內(nèi)源性的[24]。不同與人類，小鼠通常不會被念珠菌定居，因此必須進(jìn)行實驗性感染，在相同免疫條件下篩選侵襲性真菌感染的最適濃度，避免動物快速死亡或持續(xù)存活情況發(fā)生，達(dá)到較為理想的死亡率[27-28]。本研究侵襲性真菌感染小鼠選用的是側(cè)尾靜脈注射方式，即由側(cè)尾靜脈向小鼠體內(nèi)注射真菌，并將其注入血液中；小鼠靜脈內(nèi)注射真菌后，人為造成了菌血癥，感染可迅速在全身傳播，真菌在進(jìn)入血液后數(shù)小時內(nèi)侵入腎臟、腦組織、肝臟等多個器官，這也較為符合臨床上侵襲性真菌播散感染的情況。

靜脈注射真菌感染小鼠過程中，菌細(xì)胞黏附在宿主表皮或內(nèi)皮細(xì)胞的表面，侵入宿主細(xì)胞，逃避免疫系統(tǒng)，在宿主環(huán)境中生存和繁殖，然后擴(kuò)散到新組織，其死亡原因主要取決于真菌的敗血癥，但死亡率也會取決于小鼠的品系[29]。本研究中白念珠菌感染組AIDS來源GYWu27組死亡率最高，其次為VVC來源GYF76組、健康人來源N110組，說明念珠菌病的持續(xù)程度因不同的臨床分離株而異，在系統(tǒng)感染小鼠模型中比較相同的品系或分離株時，毒力差異也很明顯；研究表明白念珠菌感染不同品系小鼠的靶器官真菌負(fù)荷量Balb/c小鼠高于KM小鼠，感染期間真菌對宿主的損害也反映了宿主的免疫狀態(tài)，因為相較于Balb/c小鼠，KM小鼠自身具有繁殖率和成活率高特點，所以相同條件下自身的抗病力和適應(yīng)性更強(qiáng)。在該模型中，不同真菌菌株導(dǎo)致了不同的真菌負(fù)荷量，但真菌感染在大多數(shù)器官中得到控制，但白念珠菌在腎臟中及新生隱球菌在大腦中引起嚴(yán)重的疾病，并伴有免疫浸潤的增加。

真菌感染時，組織反應(yīng)的類型取決于機(jī)體與病原體之間的相互關(guān)系[29]。本研究表明侵襲性真菌感染動物模型感染后分離菌株真菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果皆為陽性，經(jīng)鑒定確定為實驗接種的病原菌。處死小鼠取組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，不同病原菌感染小鼠的組織病變集中位置和程度并不相同，侵襲性隱球菌感染小鼠病變集中于腦組織，其中可見大量炎性細(xì)胞浸潤和真菌感染病灶，侵襲性念珠菌感染小鼠病變集中在腎臟，以慢性炎癥為主。已有報道表明腎是小鼠白念珠菌侵襲性感染的靶器官[30]，這與本研究的結(jié)果一致，但不同品系小鼠之間的臟器病理變化基本相同。

臨床侵襲性真菌感染的主要問題之一是由于表現(xiàn)的非特異性癥狀導(dǎo)致感染的診斷困難，進(jìn)一步導(dǎo)致了有效抗真菌治療的延誤，所以侵襲性真菌感染動物模型對于了解疾病的發(fā)生和發(fā)展及宿主與真菌之間復(fù)雜的相互作用至關(guān)重要。這些模型消除了經(jīng)常從人類患者身上獲取有問題的組織樣本的麻煩，不僅是闡明真菌病分子和細(xì)胞發(fā)病機(jī)理的強(qiáng)大工具，還可以對新型抗真菌藥、免疫調(diào)節(jié)劑及潛在研制的疫苗等進(jìn)行體內(nèi)的評估。而本研究采用靜脈感染方式、以1×108CFU/L白念珠菌和1×109CFU/L新生隱球菌分別感染Balb/c小鼠和KM小鼠，可構(gòu)建穩(wěn)定的侵襲性真菌感染動物研究模型，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。