郇義超，趙佳，魏迎亮

1.沈陽市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽 110044；2.遼寧電力中心醫(yī)院，遼寧 沈陽 110006；3.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110004

近年來，骨折創(chuàng)傷發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢。下肢骨折是外科骨折傷中最易發(fā)生的情況，其中股骨骨折在臨床中最為常見［1－2］。骨折愈合是一個多種細胞因子共同參與的極其復雜而又緩慢的過程。一般而言，多數(shù)急性骨折創(chuàng)傷及時接受常規(guī)治療后便能逐漸痊愈，但仍可能出現(xiàn)大段骨缺損及骨不連的現(xiàn)象，導致骨折創(chuàng)傷有較高的致殘率［3］。骨折創(chuàng)傷后可能出現(xiàn)的畸形愈合、延遲愈合或不愈合等情況［4］，對患者的身心、工作和生活產(chǎn)生巨大的影響。因此，如何加快骨折愈合、縮短治療周期，有效規(guī)避骨折愈合延遲或不愈合風險，降低骨折對患者帶來的不良影響是骨創(chuàng)傷中亟須解決的問題。中醫(yī)治療骨折歷史悠久，主張筋骨并重、內(nèi)外兼治，療效顯著［5－6］。益氣健骨補腎方是中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，具有補腎壯骨、益氣活血化瘀的功效，治療股骨骨折臨床療效確切，但具體作用機制尚不明確。本研究從血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉化生長因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）角度出發(fā)探討益氣健骨補腎方治療大鼠股骨骨折的作用機制。

1 材料

1.1 動物60只SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質量（250±20）g，購于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK（遼）2017－0001。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，自由飲水、進食。本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查通過，倫理編號：ZGYKDX202009001。

1.2 藥物與試劑益氣健骨補腎方（熟地黃20 g，杜仲15 g，骨碎補15 g，淫羊藿15 g，山藥15 g，菟絲子15 g，龍骨15 g，紫丹參10 g，當歸10 g，紅花10 g，茯苓10 g，獨活10 g，續(xù)斷10 g，川芎10 g，牛膝10 g，甘草10 g，沈陽中藥飲片藥業(yè)有限公司，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中藥房提供）；辛伐他汀（山東鑫齊藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20 mg／片，國藥準字：H20084420）；注射用青霉素鈉（河南新鄉(xiāng)華星藥廠，國藥準字H41020817，規(guī)格：80萬U）。水合氯醛（天津市瑞金特化學品有限公司，批號：20190324）；Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)肽（typeⅠcollagen cross－linked C－telopeptide，CTX）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200514、20200712、20200819、20200622、20191103、20200811）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：20191121、20200317）。

1.3 儀器ElectroForce 3200型生物材料實驗儀（美國Instron公司）；TD－4M型離心機（離心半徑：12.5 cm，博科控股集團有限公司）；BioTek aQuant型全自動酶標儀（上海坤肯生物化工有限公司）；PDiscovery QDR型雙能X線骨密度儀（美國Hologic公司）；WDS－200型數(shù)顯式電子試驗機（濟南恒思盛大儀器有限公司），計算機X射線攝像儀（日本柯尼卡美能達公司）；TE2000型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；J－D200型生物顯微鏡（深圳拓天儀器設備有限公司）；OLYMPUS BX－51型骨組織形態(tài)計量儀（美國BIOQUANT公司）。

2 方法

2.1 藥物制備取益氣健骨補腎方組方藥材，加入8倍量水，煎煮2次，趁熱過濾，合并濾液，濃縮至濃度為1 kg·L－1，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、建模及給藥60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、阿侖膦酸鈉組及益氣健骨補腎方低、中、高劑量組，每組10只。適應性飼養(yǎng)1周后，采用閉合骨折法制備股骨骨折模型［7］。具體如下：水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，克氏針自左股骨髁間凹處穿入髓腔后拔出，徒手折斷股骨中段，骨折后停止用力，避免移位，克氏針再次沿穿針點進針到骨折遠端，針尾埋于皮下并消毒。手術完成后，大鼠肌內(nèi)注射青霉素鈉100萬U·kg－1預防感染，并采用X線判定造模是否成功。造模成功后第2天開始藥物干預，阿侖膦酸鈉組以5 mg·kg－1劑量灌胃給予阿侖膦酸鈉溶液，益氣健骨補腎方各組給藥劑量按人和大鼠的體表面積比進行折算，即益氣健骨補腎方低、中、高劑量組分別灌胃給予益氣健骨補腎方溶液2.5 g·kg－1、5.0 g·kg－1、10.0 g·kg－1，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)15 d。由于操作不當，阿侖膦酸鈉組和益氣健骨補腎方低劑量組大鼠各死亡2只，其余組大鼠死亡1只。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平大鼠麻醉后心臟取血，2 000 r·min－1離心15 min，收集血清。嚴格按試劑盒說明書要求進行操作，采用ELISA法檢測大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平。

2.4 骨轉化指標測定嚴格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測血清中TRAP、CTX、ALP、OC的水平。

2.5 雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度大鼠麻醉處死后，超凈臺剝離雙側股骨，清水沖洗，剔除軟組織，在體積分數(shù)70%的乙醇中4℃避光保存，雙能X線骨密度儀設置為2 cm階段測量大鼠股骨骨密度（bonemineral density，BMD）和組織礦物密度（tissue bonemineral density，TMD）。

2.6 骨組織形態(tài)計量儀檢測大鼠骨組織形態(tài)計量學相關指標大鼠麻醉處死后，超凈臺剝離雙側股骨，取股骨遠端干骺端組織，骨組織形態(tài)計量儀檢測骨小梁數(shù)量（number of trabecular bone，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁面積百分數(shù)（bone trabecular area percentage，TbAr%）、骨小梁分離度（bone trabecular separation，Tb.Sp）。

2.7 骨生物力學測量大鼠麻醉處死后，超凈臺剝離雙側股骨，紗布包裹置于生理鹽水中，－20℃保存。取大鼠股骨樣本采用數(shù)顯式電子試驗機進行三點彎曲實驗，股骨放置試驗機上，將立柱間長度設置為22 mm，壓頭下壓速度2 mm·min－1，直至樣本斷折，測量大鼠股骨最大應力、最大載荷和最大撓度。

2.8 HE染色觀察股骨組織病理變化取股骨上端標本，4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣1月，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察股骨組織病理變化。

2.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 益氣健骨補腎方對大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補腎方高劑量組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的 水 平 顯 著 升 高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補腎方可顯著升高股骨骨折模型大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平。見表1。

表1 各組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平比較 （±s）

表1 各組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n Ⅰ型膠原（ρ／μg·L－1） bFGF（ρ／ng·L－1） TGF－β1（ρ／ng·L－1） VEGF（ρ／ng·L－1）3.20±26.78模型組 9 14.65±0.93* 23.31±2.42* 100.07±11.45* 112.87±12.26*阿侖膦酸鈉組 8 57.04±2.02▲ 85.27±4.36▲ 151.74±17.29▲ 169.46±20.53▲益氣健骨補腎方低劑量組 8 49.63±2.78▲ 70.17±3.88▲ 138.75±15.32▲ 148.82±18.39▲益氣健骨補腎方中劑量組 9 66.85±3.26▲ 96.74±4.03▲ 173.68±18.26▲ 184.28±20.64▲益氣健骨補腎方高劑量組 9 84.48±3.63▲▼ 112.52±6.41▲▼ 200.59±20.02▲▼ 226.28±27.71▲▼空白組 9 113.49±14.21 126.75±11.89 234.86±25.47 36

3.2 益氣健骨補腎方對大鼠骨轉化指標的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著升高（P＜0.05），ALP、OC的水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著降低（P＜0.05），ALP、OC的水平顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補腎方高劑量組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著降低，ALP、OC的水平顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補腎方可顯著改善模型大鼠的骨轉化指標，且效果優(yōu)于陽性對照藥阿侖膦酸鈉。見表2。

表2 各組大鼠骨轉化指標比較 （±s）

表2 各組大鼠骨轉化指標比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n TRAP（ρ／μg·L－1） CTX（c／μmol·L－1） ALP（ρ／ng·L－1） OC（ρ／ng·L－1）6.78模型組 9 54.65±3.93* 193.31±43.42* 40.07±1.45* 239.97±30.26*阿侖膦酸鈉組 8 47.04±2.02▲ 30.27±4.36▲ 51.74±1.29▲ 291.46±20.53▲益氣健骨補腎方低劑量組 8 49.63±2.78▲ 34.17±4.88▲ 48.75±1.32▲ 278.82±18.39▲益氣健骨補腎方中劑量組 9 46.85±1.86▲ 26.74±4.03▲ 53.68±1.26▲ 300.28±21.64▲益氣健骨補腎方高劑量組 9 44.48±1.63▲▼ 21.52±3.41▲▼ 57.59±1.02▲▼ 311.28±17.71▲▼空白組 9 43.49±1.21 10.35±3.19 59.86±1.47 337.20±2

3.3 益氣健骨補腎方對大鼠骨密度指標的影響與空白組比較，模型組大鼠BMD、TMD顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠BMD、TMD顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補腎方高劑量組大鼠BMD、TMD顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補腎方可顯著改善模型大鼠的骨密度相關指標，且作用效果優(yōu)于陽性對照藥阿侖膦酸鈉。見表3。

表3 各組大鼠股骨骨密度相關指標比較（±s）

表3 各組大鼠股骨骨密度相關指標比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n BMD／g·cm－2 TMD／g·cm－2 9 0.38±0.03 0.85±0.02模型組 9 0.23±0.02* 0.73±0.01*阿侖膦酸鈉組 8 0.29±0.02▲ 0.79±0.02▲益氣健骨補腎方低劑量組8 0.27±0.02▲ 0.77±0.01▲益氣健骨補腎方中劑量組9 0.31±0.01▲ 0.80±0.02▲益氣健骨補腎方高劑量組9 0.34±0.02▲▼0.82±0.02▲▼空白組

3.4 益氣健骨補腎方對大鼠股骨骨形態(tài)計量學相關指標的影響與空白組比較，模型組大鼠Tb.Sp顯著升高（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠Tb.Sp顯著降低（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補腎方高劑量組Tb.Sp顯著降低（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補腎方可顯著改善模型大鼠的股骨骨形態(tài)計量學相關指標，且作用效果優(yōu)于陽性對照藥阿侖膦酸鈉。見表4。

表4 各組大鼠股骨骨形態(tài)計量學相關指標比較 （±s）

表4 各組大鼠股骨骨形態(tài)計量學相關指標比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n TbAr% Tb.N／個·mm－2 Tb.Th（l／μm） Tb.Sp（l／mm）9 23.35±5.78 5.69±0.42 79.36±8.57 0.20±0.01模型組 9 15.59±4.41* 4.28±0.63* 50.71±9.32* 0.31±0.03*阿侖膦酸鈉組 8 20.03±5.16▲ 5.11±0.45▲ 64.82±7.91▲ 0.25±0.02▲益氣健骨補腎方低劑量組 8 18.97±5.42▲ 4.93±0.54▲ 60.26±8.13 0.26±0.01▲益氣健骨補腎方中劑量組 9 20.54±5.17▲ 5.16±0.48▲ 68.34±8.38▲ 0.23±0.02▲益氣健骨補腎方高劑量組 9 21.79±6.18▲▼ 5.32±0.46▲▼ 71.49±7.48▲▼ 0.22±0.01▲▼空白組

3.5 益氣健骨補腎方對大鼠骨生物力學的影響與空白組比較，模型組大鼠股骨的最大應力、最大載荷和最大撓度均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨的最大應力、最大載荷和最大撓度顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補腎方高劑量組大鼠股骨的最大應力、最大載荷和最大撓度顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補腎方可顯著改善模型大鼠股骨的骨生物力學相關指標，且作用效果優(yōu)于陽性對照藥阿侖膦酸鈉。見表5。

表5 各組大鼠骨生物力學指標比較 （±s）

表5 各組大鼠骨生物力學指標比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n 最大應力（P／MPa） 最大載荷／N 最大撓度（l／mm）13.96±0.54 150.06±19.85 1.82±0.33模型組 9 9.58±0.69* 124.64±16.96* 1.27±0.24*阿侖膦酸鈉組 8 10.65±0.44▲ 134.58±17.17▲ 1.48±0.31▲益氣健骨補腎方低劑量組 8 10.39±0.41▲ 135.88±16.21▲ 1.49±0.28▲益氣健骨補腎方中劑量組 9 11.04±0.58▲ 138.23±16.16▲ 1.56±0.26▲益氣健骨補腎方高劑量組 9 11.29±0.47▲▼ 142.63±17.82▲▼ 1.69±0.27▲▼空白組9

3.6 益氣健骨補腎方對大鼠骨組織形態(tài)的影響空白組大鼠股骨組織形態(tài)正常；模型組大鼠股骨組織局部血腫機化，骨膜增厚，成骨細胞數(shù)量較少，可見大量軟骨細胞；各給藥組大鼠股骨組織局部血腫改善，骨膜變薄，軟骨細胞減少，成骨細胞數(shù)量明顯增多，骨折愈合情況較好。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)比較（HE染色，×100）

4 討論

中醫(yī)認為，骨折愈合為“祛瘀、新生和骨合”的過程［6］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認為“血不活而骨不能接”，故活血化瘀是治療骨折的主要方法［8］。腎藏精，主骨生髓，髓能養(yǎng)腦、充骨、化生血液。腎精充實，則骨髓化生有源，筋骨堅韌，強健有力；反之，腎精虧虛，則骨髓乏源，骨失濡養(yǎng)，脆弱無力。因此，骨折的病機主要為腎虛精虧、瘀血阻滯，臨床治療宜以補腎壯骨為主，補肝益氣、活血化瘀為輔。益氣健骨補腎方中熟地黃補血養(yǎng)陰、填精益髓；淫羊藿、菟絲子和杜仲補肝腎、強筋骨、益精；續(xù)斷和骨碎補補肝腎、強骨筋；獨活通痹止痛；丹參、紅花、當歸、牛膝、川芎活血化瘀；甘草補脾氣、調(diào)和諸藥，全方共奏補腎壯骨、活血化瘀功效?，F(xiàn)代研究證實，骨碎補總黃酮可激活成骨細胞，明顯增加骨密度，促進蛋白多糖合成進而促進鈣化，促進骨生長［9］；牛膝總皂苷可升高血清骨鈣素和堿性磷酸酶水平，改善骨代謝［10］；續(xù)斷可以增加骨密度，改善骨小梁微結構，提高股骨強度，調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收指標，降低骨轉換率，降低骨折風險［11］；杜仲能降低血鈣水平，升高血磷水平，促進骨折斷端礦物質的沉積，促進骨折愈合［12］；丹參可顯著增加骨密度，降低磷含量［13］。

膠原是細胞外基質的一種結構蛋白質，主要存在于結締組織中，其中，Ⅰ型膠原是骨骼有機質的重要組成部分，主要在骨骼和結締組織內(nèi)發(fā)揮作用，對骨架的形成和骨架完整性的保持具有重要意義［14－16］。本研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折模型大鼠血清中Ⅰ型膠原的水平顯著降低；給予益氣健骨補腎方干預后，大鼠血清中Ⅰ型膠原的水平顯著升高；說明益氣健骨補腎方可通過改善膠原蛋白，促進股骨骨折愈合。

bFGF是FGF2基因編碼的生長因子和信號蛋白［17］，對成骨細胞和軟骨細胞的生長具有重要作用［18］。bFGF可與成纖維細胞生長因子受體、肝素結合生長因子－2和內(nèi)皮細胞生長因子－2特異結合并發(fā)揮作用［19－20］。正常情況下，bFGF存在于基底膜和血管內(nèi)皮下細胞外基質中，當機體發(fā)生損傷時，bFGF激活，介導形成新血管，促進骨折愈合。此外，研究顯示，bFGF還能與bFGF－1受體結合，促使成骨前細胞加速增殖，從而促進受損骨骼的愈合［21］。本研究顯示，股骨骨折模型大鼠血清中bFGF的水平顯著降低；給予益氣健骨補腎方干預后，大鼠血清中bFGF的水平顯著升高；說明益氣健骨補腎方可提高模型大鼠血清中bFGF的水平。

骨痂中的TGF－β1同樣是參與骨愈合和骨生成的一種重要細胞因子，TGF－β1與受體結合后，可激活下游底物和調(diào)節(jié)蛋白，促進細胞的分化、增殖［22－23］。骨 折 愈 合 過 程 中 蛋 白 復 合 體 激 活TGF－β1，使TGF－β1高表達［24－25］。高氧狀態(tài)下，VEGF可影響骨折修復進程。研究顯示，VEGF可提高骨折大鼠Ⅷ因子相關抗原含量，促進骨組織供血體系重建［26－27］。本研究顯示，股骨骨折模型大鼠血清中TGF－β1、VEGF的水平顯著降低；給予益氣健骨補腎方干預后，大鼠血清中TGF－β1、VEGF水平均明顯升高；說明益氣健骨補腎方可提高模型大鼠血清中TGF－β1和VEGF的水平。

CTX－1是I型膠原降解產(chǎn)物，其血清水平能特異性反映破骨細胞活性。TRAP為破骨細胞分泌的非膠原蛋白，與骨吸收水平成正相關［28－30］。ALP為堿性磷酸酶，OC為骨基質標志物，兩者均由成骨細胞產(chǎn)生，反映骨形成狀態(tài)。骨密度是反映骨量的有效指標［31－33］。骨強度、骨結構、骨量等骨生物力學指標是骨組織結構和功能的有效指標，通過剛度和硬度可反映骨折風險程度。骨生物力學性能降低為骨折的重要原因，也是評價藥物療效的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折模型大鼠TRAP、CTX－1、Tb.Sp的水平顯著升高，ALP、OC、BMD、TMD、Tb.N、Tb.Th、TbAr%的水平及股骨的最大應力、最大載荷和最大撓度顯著降低；給予益氣健骨補腎方干預后，大鼠TRAP、CTX－1、Tb.Sp的水平顯著降低，而ALP、OC、BMD、TMD、Tb.N、Tb.Th、TbAr%的水平及股骨的最大應力、最大載荷和最大撓度均顯著升高；提示，益氣健骨補腎方可顯著改善模型大鼠的骨轉化、骨密度、股骨骨形態(tài)計量學及骨生物力學相關指標。

綜上所述，益氣健骨補腎方能顯著升高股骨骨折大鼠的Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF，改善骨轉化，增加骨密度，改善骨顯微結構，提升骨生物力學性能，促進骨折愈合。