楊明，范小琴，鄢敏，韓靈，鄭朝攀

(1.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518020； 2.深圳市納米酶腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 深圳市第二人民醫(yī)院/深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518035)

腫瘤微環(huán)境 (tumor microenviroment, TME) 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞 (cancer associated fibroblasts, CAFs)作為TME中數(shù)量最豐富的一類細(xì)胞，是TME的重要組成成分，并通過與腫瘤細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，成為近年靶向TME治療的研究熱點(diǎn)[1-3]。在TME中CAFs通過分泌多種細(xì)胞因子(cytokine)、趨化因子(chemokine)和炎性因子(inflammatory cytokines) 等激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[4-5]。然而，大量研究顯示在TME中不同腫瘤類型或不同腫瘤來源的CAFs細(xì)胞存在高度的異質(zhì)性，導(dǎo)致CAFs的類型和生物學(xué)作用存在很大差異[6]。因此分離、培養(yǎng)和鑒定不同類型TME中的CAFs成為目前TME研究的前沿問題[7]。目前，針對(duì)TME中CAFs的研究較少[8]。本研究通過鼻咽癌和鼻咽炎新鮮組織3D 培養(yǎng)的新方法，分離、培養(yǎng)和鑒定CAFs，為研究CAFs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中生物學(xué)作用等基礎(chǔ)研究提供了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑耗材 I型膠原酶(Sigma 公司 #SCR103)，胰蛋白酶(Sigma 公司 #T1426)，PBS(Hyclone 公司 #SH30256)，胎牛血清(Sigma 公司 #F8687)，DMEM (Gibco 公司#C11995065)，RPMI-1640 (Gibco 公司 #C11875500BT), CAFs標(biāo)志物檢測試劑盒 (CST公司 #31549)， ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Protein technology 公司 #PK10002)，Matrigel (Corning公司 #356234)，青鏈霉素 (Hyclone公司 #SV30010)，BCA蛋白定量試劑盒 (Protein technology公司 #23225)，RIPA細(xì)胞裂解液 (碧云天公司 # P0013B)，DMSO (Sigma公司 #D8779)，蛋白酶抑制劑(Roche公司# 4693116001)，磷酸酶抑制劑(Roche 公司 # 4906837001)。

1.1.2 組織樣本 收集深圳市人民醫(yī)院2020年1—6月臨床病理鑒定的新鮮鼻咽癌組織和鼻咽炎組織各3例。新鮮組織經(jīng)鼻內(nèi)鏡取下后立即置于含有50 % RPMI-1640，40 % FBS，10 % DMSO組織保存液中，30 min內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。所有納入研究的臨床患者均告知并同意簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 新鮮組織用含有100 μg/mL 青鏈霉素的PBS洗2次，然后用眼科剪子剪碎。加5 mL I型膠原酶混勻，37℃條件下孵育1h，300 rpm, 離心5 min，棄上清。加入2 mL，0.25%的胰酶，37℃條件下孵育10 min，加等體積20% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止，300 rpm, 離心5 min，棄上清。再加入2 mL 20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，過100目分子篩，收集過濾液體1 200 rpm, 離心5 min，棄上清。

消化后的單細(xì)胞懸液用20 μL DMEM培養(yǎng)基重懸后，加入300 μL的Matrigel 混勻，取30 μL混合液在6孔板中種3D球培養(yǎng)，加完后立即倒扣置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min。在加入2.5 mL 含10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，間隔2 d換1次液。

1.2.2 成纖維細(xì)胞傳代 正常培養(yǎng)1周后，在3D Matrigel 球周圍長出呈長梭狀的細(xì)胞的成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts,NFs)，取出培養(yǎng)皿，用槍輕輕將Matrigel的球吹落棄掉，培養(yǎng)皿里貼壁生長的細(xì)胞為我們需要的成纖維細(xì)胞。用胰酶消化重新鋪板，培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代5代后，收集細(xì)胞用于后續(xù)鑒定。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測CAFs的標(biāo)準(zhǔn)物的表達(dá) 將穩(wěn)定傳代5代的CAFs，將細(xì)胞正常消化后，鋪于細(xì)胞爬片上，48 h后收集細(xì)胞，用4% PFA室溫固定半小時(shí)，PBS洗2次，0.2% Triton X-100的PBS透化10 min，含10%山羊血清的PBS封閉1 h，2%山羊血清的PBS配制的一抗4℃孵育過夜，PBS洗兩次，相應(yīng)熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗2次，DIPA室溫避光孵育10 min，PBS洗2次，封片、成像、拍照。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測CAFs標(biāo)準(zhǔn)物的表達(dá) 將穩(wěn)定傳代5代的CAFs總蛋白用RIPA(加入1X蛋白酶抑制劑和1X磷酸酶抑制劑) 裂解液裂解提取。總蛋白濃度用BCA蛋白定量法提取。總蛋白10 μg用10 %的SDS-PAGE跑膠分離后，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗[波形蛋白(Vimentin)，血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscleactin,a-SMA)和甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydro genase,GAPDH)的稀釋濃度按1∶1 000)孵育過夜、二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠的稀釋濃度按1∶2 000)、ECL顯影。

1.2.5 細(xì)胞增殖CCK8實(shí)驗(yàn) 收集成功傳代5代的成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/mL，按每孔2 000個(gè)接種于96孔板中，每組做3個(gè)副孔，分別在24、48、72 h，棄培養(yǎng)基，加入含10 μL CCK8試劑的無血清DMEM培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)箱孵育3 h后，上酶標(biāo)儀檢測OD450 nm的吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌CAFs胞形態(tài)學(xué)觀察

本研究通過3D培養(yǎng)的方法培養(yǎng)1周后，發(fā)現(xiàn)在3D球周圍長出呈長梭形、條束狀，胞質(zhì)豐富，胞核位于胞體中央。用槍輕輕吸取培養(yǎng)基吹掉3D球后，再用PBS清洗后，加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)置長滿6孔板，用胰酶正常消化傳代。

正常傳代5次后，結(jié)果如圖1所示NFs生長速度較慢，扁平狀，邊緣規(guī)則，細(xì)胞排列按一定方向無重疊生長。而與NFs相比，CAFs生長速度較快，長梭形，胞漿豐富，邊緣不規(guī)則形成毛刺狀突起，細(xì)胞間排列不規(guī)則。

圖1 原代分離成纖維細(xì)胞形態(tài) (SP ×40) a:NFs； b:CAFs

2.2 鼻咽癌CAFs標(biāo)準(zhǔn)物免疫熒光鑒定

為了鑒定分離的成纖維細(xì)胞純度，將細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光染色，圖2所示NFs和CAFs 細(xì)胞Vimentin染色都呈強(qiáng)陽性，證實(shí)這兩種細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin。而與NFs相比，a-SMA作為CAFs的特異性標(biāo)志物在CAFs中表達(dá)呈強(qiáng)陽性，這一結(jié)果證實(shí)鼻咽癌腫瘤中CAFs高表達(dá)a-SMA。

圖2 原代分離成纖維細(xì)胞免疫熒光染色 (免疫熒光 ×40) a：NFs; b：CAFs

2.3 鼻咽癌CAFs高表達(dá)a-SMA

隨后，我們將穩(wěn)定傳代5代后的細(xì)胞通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測CAFs標(biāo)準(zhǔn)物Vimentin，a-SMA在CAFs中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與NFs相比，Vimentin的表達(dá)水平基本一致，但a-SMA在CAFs中的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)鼻咽癌CAFs高表達(dá)a-SMA。

圖3 Westem blot檢測鼻咽炎組織中NFs與鼻咽癌組織中的CAFs表達(dá)情況

2.4 鼻咽癌CAFs增殖能力

我們將穩(wěn)定傳代5代后的細(xì)胞，消化后鋪板，每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，分別在24、48、72 h后加入CCK8試劑孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測檢測在450 nm波長處側(cè)吸收值(OD值)，每組檢測結(jié)果如表1所示。

表1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

根據(jù)檢測結(jié)果繪制生長曲線如圖4所示，與NFs 相比，CAFs的增殖速度明顯加快，增殖能力明顯增加。

圖4 NFs與CAFs的增殖能力曲線圖

3 討論

研究顯示在TEM中CAFs促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)已經(jīng)被廣大研究者認(rèn)同[9]。由于不同腫瘤來源的CAFs存在高度異質(zhì)性，其在TEM中的作用和分子機(jī)制仍然存在著很多未知的領(lǐng)域，尤其CAFs在腫瘤免疫治療方面，近年研究證實(shí)CAFs是抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，因此原代分離、純化和鑒定不同腫瘤特異的CAFs可為后續(xù)研究提供材料依據(jù)[10-11]。近年研究報(bào)道中尚無鼻咽癌CAFs原代培養(yǎng)、鑒定的報(bào)道，本研究參照國內(nèi)外報(bào)道的CAFs原代酶消化分離方法并結(jié)合3D培養(yǎng)，成功分離培養(yǎng)并鑒定了高純度的鼻咽癌CAFs。

近年，研究報(bào)道的原代分離CAFs的方法主要是組織塊貼壁法和酶消化法。其中組織塊貼壁法雖然簡單易行，但也存在如周期長、純度差和效率低等缺點(diǎn)。酶消化法則周期短，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但由于腫瘤組織經(jīng)酶消化后是多種細(xì)胞的混合體，所以在培養(yǎng)純度上存在很大問題[12]。本研究將組織經(jīng)酶消化后，結(jié)合Matrigel混合通過3D球培養(yǎng)，利用成纖維細(xì)胞貼壁生長的特性，在培養(yǎng)過程中簡單快速將成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞分離，且能保證細(xì)胞活性。

原代細(xì)胞體外培養(yǎng)，最重要的就是保持細(xì)胞的生物學(xué)特性，我們通過此法可以得到高純度的成纖維細(xì)胞，且經(jīng)過多次傳代后再通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光染色，Q-PCR和Western blot技術(shù)等對(duì)成纖維細(xì)胞的特異蛋白標(biāo)志物進(jìn)行檢測，對(duì)分離的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了定性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌CAFs與NFs相比，在細(xì)胞形態(tài)，蛋白標(biāo)志物和生物學(xué)特性等方面存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌CAFs細(xì)胞較大，梭形，胞漿豐富，邊緣不規(guī)則形成毛刺狀突起，細(xì)胞間排列不規(guī)則；特異蛋白標(biāo)志物Vimentin，a-SMA的表達(dá)呈陽性，據(jù)此我們對(duì)鼻咽癌CAFs進(jìn)行了鑒定。以上結(jié)果與胃癌、肝癌等腫瘤體外分離培養(yǎng)的CAFs與NFs的表型特性相似，證實(shí)我們的方法和鑒定結(jié)果是可靠可行的[13-14]。

最后，我們對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行了初步鑒定，CCK8檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于NFs、CAFs的增殖能力更強(qiáng)，這也證實(shí)在鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞CAFs處于激活狀態(tài)，從而可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究成功分離、純化并鑒定了鼻咽癌CAFs，有望進(jìn)一步結(jié)合臨床治療研究、CAFs基因遺傳命運(yùn)圖譜和單細(xì)胞測序等先進(jìn)生物技術(shù)手段，闡明CAFs在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)作用和抗腫瘤免疫治療方面提供了新的材料研究基礎(chǔ)。