戴裕杰，關(guān)榮發(fā),，黃海智，孫玉敬，何榮軍，楊 開(kāi)，蔡 銘

（1.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

作為N-亞硝基化合物中的一類，目前已知的N-亞硝胺約有300 種，其基本結(jié)構(gòu)為R1(R2)N—N＝O，且大部分具有致癌性。N-亞硝胺廣泛存在于飲料和酒類[1-2]、醬油[3]、 蔬菜制品[4-6]、水產(chǎn)品[7-9]、肉及肉制品[10-11]等食品中。食品中的N-亞硝胺可分為揮發(fā)性N-亞硝胺和非揮發(fā)性 N-亞硝胺兩類，而揮發(fā)性N-亞硝胺的致癌作用強(qiáng)于非揮發(fā)性N-亞硝胺[12]。食品中常見(jiàn)的揮發(fā)性N-亞硝胺包括 N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基甲乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）等。1987年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將N-亞硝胺定義為強(qiáng)致癌性食品污染物，并將NDMA和NDEA列為2A類致癌物[13]。

中式臘肉是一種以畜肉為原料，配以其他輔料，經(jīng)腌制、烘干（或曬干、風(fēng)干）、煙熏（或不煙熏）等工藝加工而成的非即食肉制品[14]。煙熏臘肉主要在四川和湖南生產(chǎn)消費(fèi)[15-16]，因其獨(dú)特的風(fēng)味和易于保存的特性而深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?ài)。在臘肉腌制過(guò)程中常會(huì)加入亞硝酸鹽，以起到發(fā)色、抗氧化和抑菌的作用[17]，進(jìn)而提高產(chǎn)品的食用品質(zhì)和生物安全性。但在臘肉加工和后續(xù)貯藏過(guò)程中，特別是在酸性條件下，亞硝酸鹽會(huì)和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的仲胺通過(guò)亞硝化反應(yīng)生成N-亞硝胺[18]。此外，以豬肉這類紅肉作為制作原料[11,19]以及采用烘烤煙熏的熱加工方式[20-21]都會(huì)提高臘肉中N-亞硝胺的含量水平。臘肉中N-亞硝胺的存在，嚴(yán)重影響其食用安全性并對(duì)公眾健康安全構(gòu)成威脅。GB 2762—2017《食品中污染物限量》要求肉制品中NDMA含量應(yīng)不大于3.0 μg/kg[22]；而美國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定腌制肉類中總揮發(fā)性N-亞硝胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為10.0 μg/kg。目前，尚未有研究報(bào)道中式臘肉中N-亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)水平，因而有必要對(duì)代表性產(chǎn)地中式臘肉中N-亞硝胺的種類和含量進(jìn)行檢測(cè)并評(píng)估其風(fēng)險(xiǎn)水平。

QuEChERS方法通過(guò)使用萃取鹽和吸附劑將前處理中的提取和凈化相結(jié)合，相比固相萃取[23-24]和固相微萃取[11,25]無(wú)需專用設(shè)備，具有簡(jiǎn)便、廉價(jià)的特點(diǎn)。該方法目前已在部分動(dòng)物性食品中N-亞硝胺檢測(cè)的前處理環(huán)節(jié)使用[8,10,26-27]，但尚未用于中式臘肉。此外，臘肉中N-亞硝胺含量低，且基質(zhì)復(fù)雜（含脂肪、煙熏和香辛料等成分），因此需基于QuEChERS法對(duì)前處理中的提取、凈化和濃縮環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。目前，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)憑借其出色的分離能力和高靈敏度已廣泛應(yīng)用于食品中N-亞硝胺的檢測(cè)[1,6,11]。綜合儀器的靈敏度和通用性，本研究采用GB 5009.26—2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》第1法中的氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[28]進(jìn)行分離定量。

本研究旨在采用改進(jìn)的QuEChERS和GC-MS法建立測(cè)定中式臘肉中8 種揮發(fā)性N-亞硝胺（包括NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）的檢測(cè)方法。系統(tǒng)優(yōu)化提取溶劑種類、超聲時(shí)間、冷凍時(shí)間、吸附劑種類和用量、氮吹水浴溫度以及氮吹定容體積，并從線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度方面對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，應(yīng)用該方法檢測(cè)12 份代表性市售樣品，評(píng)估目前中式臘肉中N-亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)水平，并分析產(chǎn)地和豬肉種類對(duì)N-亞硝胺含量影響的顯著性。以期能為臘肉及其他肉制品中N-亞硝胺的控制工藝研發(fā)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和法規(guī)完善提供方法支持和數(shù)據(jù)借鑒。

圖1 8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of eight volatile N-nitrosamines

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12 份代表性中式臘肉樣品（四川和湖南各6 份）均購(gòu)自電商平臺(tái)；通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇基質(zhì)最復(fù)雜的7號(hào)中式臘肉（豬五花）樣品作為前處理優(yōu)化和方法評(píng)價(jià)中的實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，計(jì)算回收率時(shí)扣除其N-亞硝胺本底含量。

乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純） 杭州高晶精細(xì)化工有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilane，C18） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲殼素、殼聚糖、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）、納米Fe3O4上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-亞硝胺混標(biāo)（2 mg/mL，含NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR） 美國(guó)o2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-215YD E冰箱 青島海爾股份有限公司；PL403電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司； NP-30旋渦混合器 常州恩培儀器制造有限公司； KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DW-FW251超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；Allegra X-30R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó) Beckman Coulter公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 提取

將樣品去皮后切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉丁，混勻后－20 ℃冷凍3 h以上。取適量樣品放入粉碎機(jī)中絞碎，稱取10 g（精確至0.01 g）試樣至50 mL聚丙烯離心管中。加入10 mL乙腈，渦旋10 s混勻；再加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋10 s、振蕩5 s混勻；30 ℃超聲波輔助提取10 min。

1.3.1.2 凈化

－40 ℃冷凍20 min后，0 ℃、8 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一含300 mg PSA和900 mg無(wú)水硫酸鈉的50 mL離心管中，渦旋1 min后，0 ℃、8 000 r/min離心10 min。

1.3.1.3 濃縮

將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，30 ℃水浴氮吹至約1 mL。將濃縮液移取至濃縮管中，室溫氮吹至300 μL。用1 mL注射器吸取樣液，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后注入含內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中，－20 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混標(biāo)儲(chǔ)備液（1 000 ng/mL）的配制：準(zhǔn)確移取25 μL混標(biāo)原液于50 mL容量瓶，乙腈定容。

溶劑混標(biāo)工作液的配制：用乙腈將混標(biāo)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、50、150、500 ng/mL的溶劑混標(biāo)工作液。

基質(zhì)混標(biāo)工作液的配制：取7號(hào)樣品按1.3.1.1節(jié)和1.3.1.2節(jié)處理，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，30 ℃水浴完全氮吹干后分別加入300 μL 5、10、20、50、150 ng/mL 和500 ng/mL的溶劑混標(biāo)工作液，渦旋混勻。

上述標(biāo)液均置于－20 ℃保存。

1.3.3 GC-MS條件

參考相關(guān)文獻(xiàn)[27,29]方法進(jìn)行分析。DB-WAX極性毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，以20 ℃/min升至120 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，最后以20 ℃/min升至240 ℃；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣（氦氣）流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量2 μL。

電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式。8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 8 種揮發(fā)性N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（500 ng/mL）Fig. 2 Chromatograms of a mixture of eight volatile N-nitrosamine standards (500 ng/mL)

表1 8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters for eight volatile N-nitrosamines

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果以±s表示。分別采用單因素方差分析Tukey檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)確定多組和2 組數(shù)據(jù)均值間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑種類和超聲時(shí)間

提取不同動(dòng)物性食品基質(zhì)中N-亞硝胺實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取溶劑有所不同[9,24,29]。因此，本實(shí)驗(yàn)綜合采用5 種不同極性的溶劑（乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯）對(duì)加標(biāo)樣品中8 種不同極性的N-亞硝胺[30]進(jìn)行提取。樣品按1.3.1.1節(jié)提取，加入不同溶劑前均勻滴加200 μL 500 ng/mL的溶劑混標(biāo)工作液并室溫靜置15 min[10]進(jìn)行加標(biāo)處理（后續(xù)加標(biāo)方式同此），其中超聲提取0 min；并按1.3.1.2節(jié)凈化，其中－40 ℃冷凍10 min，僅使用900 mg無(wú)水硫酸鈉作為凈化填料。將提取凈化后的樣液50 ℃水浴充分氮吹，上述溶劑對(duì)應(yīng)的共提取雜質(zhì)體積分別約為0.2、0.5、1.0、1.4 mL和1.8 mL?？梢?jiàn)正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯這3 種親油性溶劑對(duì)高脂肪食品中油脂的溶解性較高[24,27]。為降低后續(xù)凈化難度同時(shí)滿足500 μL以下氮吹定容體積的要求，因此選擇乙腈作為提取溶劑（圖3a）。此外，Qiu Yuesheng[8]和Dong Hao[9]等的研究結(jié)果表明，采用乙腈提取N-亞硝胺相比其他溶劑具有更高的回收率。

圖3 提取條件對(duì)8 種揮發(fā)性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 3 Effect of extraction conditions on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

而陶森等[29]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯（96.3%）相比乙腈（87.4%）對(duì)NDMA的提取回收率更高。為進(jìn)一步提高8 種N-亞硝胺的回收率，采用乙腈結(jié)合超聲波輔助提取。加標(biāo)樣品按1.3.1.1節(jié)提取，超聲提取不同時(shí)間（0、10 min和20 min）；凈化處理同提取溶劑種類優(yōu)化；按1.3.1.3節(jié)濃縮，其中水浴溫度50 ℃、氮吹濃縮至500 μL。如圖3b所示，超聲提取10 min相比不處理（0 min），5 種N-亞硝胺（除NDBA、NPIP和NMOR）的回收率均有顯著提高（P＜0.05）。而隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)到20 min，部分小分子質(zhì)量、低沸點(diǎn)的N-亞硝胺（NDMA、NMEA、NDEA和NDPA）的回收率相比10 min出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），這可能是萃取鹽進(jìn)一步吸水放熱和超聲提取熱效應(yīng)造成的損失。因此，選擇超聲提取時(shí)間為10 min。

2.1.2 冷凍時(shí)間、吸附劑種類和用量

中式臘肉中脂肪含量較高，尤其是以豬五花肉為原料制作的臘肉。雖然采用乙腈提取能夠明顯減少脂肪類共萃取物，但提取液中仍會(huì)保留少量的脂類物質(zhì)。提取液經(jīng)氮吹濃縮，其中雜質(zhì)的比例會(huì)進(jìn)一步提高，從而影響結(jié)果定量的準(zhǔn)確性。根據(jù)脂類在低溫下易凝固的特性及其與N-亞硝胺熔點(diǎn)的差異，可利用冷凍和低溫離心的方法使脂肪從提取液中析出并與之分離[13,29]。加標(biāo)樣品按1.3.1.1節(jié)提??；按1.3.1.2節(jié)凈化，分別冷凍不同時(shí)間（0、10、20 min和30 min），其中僅使用900 mg無(wú)水硫酸鈉作為凈化填料；濃縮處理同超聲時(shí)間優(yōu)化。隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，除脂效果會(huì)更加徹底，但當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至30 min，NMOR的回收率出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05） （圖4）。因此，確定最佳冷凍時(shí)間為20 min。

圖4 冷凍時(shí)間對(duì)8 種揮發(fā)性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 4 Effect of freezing time on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

冷凍凈化后的上清液呈淡黃綠色，將其充分氮吹，離心管底部仍有微量紅色油狀雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)分別采用6 種不同除雜效果的吸附劑（PSA[3,27]、C18[3,26]、甲殼 素[31-33]、殼聚糖[32-33]、MWCNTs[34-35]和納米Fe3O4[36]）結(jié)合無(wú)水硫酸鈉作為QuEChERS凈化填料進(jìn)行第2步凈化。樣品按1.3.1.1節(jié)提取；按1.3.1.2節(jié)凈化，其中凈化填料分別采用6 種不同吸附劑+900 mg無(wú)水硫酸鈉的形式。在200、300 mg和400 mg添加量條件下，提取液經(jīng)PSA凈化并充分氮吹后離心管底部無(wú)明顯油狀物殘留，其凈化效果均明顯優(yōu)于其他5 種吸附劑。這可能是由于經(jīng)冷凍凈化后提取液中保留的主要是少量極性共萃取物，它們更易通過(guò)極性相互作用與PSA結(jié)合。在已加入PSA的50 mL離心管中添加10 mL 10 ng/mL的溶劑混標(biāo)工作液，渦旋1 min后0 ℃、8 000 r/min離心10 min，濃縮處理同超聲時(shí)間優(yōu)化，考察不同PSA用量（200、300 mg和400 mg）對(duì)8 種N-亞硝胺回收率的影響。由表2可知，當(dāng)用量增加到400 mg時(shí)，NDMA、NDBA和NPYR的回收率均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），因而選擇300 mg作為PSA的最終用量。在此基礎(chǔ)上，確定凈化填料的最佳組合為300 mg PSA+900 mg無(wú)水硫酸鈉。

表2 吸附劑種類和用量對(duì)8 種揮發(fā)性N-亞硝胺回收率的影響Table 2 Effects of adsorbent types and amounts on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

2.1.3 氮吹水浴溫度和氮吹定容體積

8 種N-亞硝胺為低分子質(zhì)量、易揮發(fā)性物質(zhì)，根據(jù)超聲提取溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（該因素未列出），其回收率易受溫度影響。取10 mL 10 ng/mL溶劑混標(biāo)工作液按1.3.1.3節(jié)濃縮至500 μL，考察不同水浴溫度（30、40、50、60 ℃和70 ℃）對(duì)8 種N-亞硝胺回收率的影響。如圖5a所示，當(dāng)水浴溫度從30 ℃升至40 ℃，NDMA、NMEA和NDEA 3 種N-亞硝胺的回收率出現(xiàn)顯著下降 （P＜0.05）。為保證小分子質(zhì)量N-亞硝胺的回收率，最終采用30 ℃的氮吹水浴溫度。

圖5 濃縮條件對(duì)8 種揮發(fā)性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 5 Effects of condensation conditions on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

為提高方法的靈敏度，需將樣液濃縮至微量體積。取10 mL 10 ng/mL溶劑混標(biāo)工作液按1.3.1.3節(jié)氮吹濃縮至不同體積（0、100、300 μL和500 μL）。如圖5b所示，當(dāng)采用完全吹干（0 μL）后加對(duì)應(yīng)體積溶劑的定容方式時(shí)，會(huì)造成8 種N-亞硝胺回收率的顯著下降 （P＜0.05），這與Dong Hao等[9]的研究結(jié)果一致。而選擇氮吹至近干后定容的方式，在微量定容體積條件下會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生較大偏差。因而選擇先將樣液水浴氮吹至約1 mL再轉(zhuǎn)移至濃縮管常溫氮吹至對(duì)應(yīng)定容體積的方式進(jìn)行濃縮。分別考察濃縮至100、300 μL和500 μL對(duì)8 種N-亞硝胺回收率的影響，結(jié)果表明當(dāng)?shù)禎饪s至300 μL時(shí)8 種N-亞硝胺的回收率相較500 μL無(wú)顯著下降，同時(shí)能在一定程度上降低方法的定量限。而當(dāng)濃縮至100 μL時(shí)，由于定容體積過(guò)小，無(wú)法保證部分N-亞硝胺的回收率。因此，最終選擇將樣液氮吹濃縮至300 μL。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限結(jié)果

按1.3.3節(jié)方法分別對(duì)6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度（5、10、20、50、150 ng/mL和500 ng/mL）的溶劑和基質(zhì)混標(biāo)工作液進(jìn)行檢測(cè)，以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)、目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到相應(yīng)的線性方程和相關(guān)系數(shù)?；|(zhì)和溶劑線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.997（表3僅為基質(zhì)的），表明目標(biāo)物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, matrix effects, limits of detection and limits of quantification for eight volatile N-nitrosamines

通過(guò)計(jì)算基質(zhì)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線間斜率的比值考察基質(zhì)效應(yīng)[8]。根據(jù)SANTE文件[37]，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為0.8～1.2時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，可忽略其對(duì)結(jié)果的影響。由表3可知，8 種N-亞硝胺的基質(zhì)效應(yīng)為0.86～0.98，表現(xiàn)為不同程度的基質(zhì)抑制，但整體較弱，這表明通過(guò)低溫冷凍結(jié)合PSA兩步凈化實(shí)現(xiàn)了良好的除雜效果。但為獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究仍采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行校正定量。

分別將定量離子信噪比為3∶1和10∶1時(shí)每種目標(biāo)物的含量定義為該方法的檢出限和定量限。如表3所示，該方法8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的檢出限和定量限范圍分別為0.05～0.14 μg/kg和0.15～0.47 μg/kg，其定量限水平均低于GB 5009.26—2016《N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》第一法的定量限（1.0 μg/kg）[28]，這表明方法的靈敏度較高。

2.2.2 平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果

取10 g粉碎后的7號(hào)樣品于50 mL離心管中，分別添加200 μL 15、50 ng/mL和150 ng/mL低中高3 個(gè)添加量（0.3、1.0 μg/kg和3.0 μg/kg）的溶劑混標(biāo)工作液進(jìn)行加標(biāo)處理。按1.3.1節(jié)和1.3.3節(jié)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。如表4所示，8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的平均回收率為71.3%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～11.2%，均在SANTE文件規(guī)定的可接受范圍內(nèi)（70%≤平均回收率≤120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%）[37]。

表4 8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Average recoveries and relative standard deviations of eight volatile N-nitrosamines

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

采用建立的方法對(duì)12 份代表性中式臘肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示，中式臘肉中主要的揮發(fā)性N-亞硝胺為NDMA、NDEA、NDBA、NPIP、NMEA和NDPA，其檢出率和平均含量分別為41.7%～58.3%和0.33～0.74 μg/kg， 其中NMOR未檢出。目前國(guó)標(biāo)中尚未對(duì)總揮發(fā)性N-亞硝胺含量進(jìn)行限定，本研究以樣品中8 種揮發(fā)性N-亞硝胺含量之和作為樣品中的總揮發(fā)性N-亞硝胺含量。參照GB 2762—2017和美國(guó)農(nóng)業(yè)部的限量標(biāo)準(zhǔn)，將單項(xiàng)和總N-亞硝胺的限量水平分別設(shè)置為3.0 μg/kg和10.0 μg/kg。12 份樣品中僅1 份樣品的NDEA含量（3.06 μg/kg）超標(biāo)，而總揮發(fā)性N-亞硝胺含量均未超標(biāo)，這表明目前市售中式臘肉中揮發(fā)性N-亞硝胺的含量水平整體較低。這可能與近年來(lái)臘肉生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)有關(guān)，如亞硝酸鹽添加量的控制、衛(wèi)生狀況的改善和低溫?zé)熝夹g(shù)的運(yùn)用等。此外，由表6可知，產(chǎn)地和豬肉種類對(duì)中式臘肉中總揮發(fā)性N-亞硝胺含量均未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

表5 12 份中式臘肉樣品中8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的含量水平Table 5 Contents of eight volatile N-nitrosamines in 12 Chinese bacon samples

表6 產(chǎn)地和豬肉種類對(duì)12 份中式臘肉樣品中總揮發(fā)性 N-亞硝胺含量的影響Table 6 Effect of geographical origin and pork cuts on contents of total volatile N-nitrosamine in 12 Chinese bacon samples

3 結(jié) 論

本研究基于QuEChERS前處理方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。采用冷凍和PSA兩步凈化降低基質(zhì)效應(yīng)（0.86～0.98）；通過(guò)氮吹濃縮至300 μL提高方法靈敏度（定量限0.15～0.47 μg/kg）；利用乙腈結(jié)合超聲波輔助提取提高方法準(zhǔn)確度（回收率71.3%～94.1%）?；诟倪M(jìn)的QuEChERS法和GC-MS法建立的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，適用于中式臘肉中8 種揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定。而該法是否適用于其他原料種類的臘肉制品及動(dòng)物性食品中N-亞硝胺的檢測(cè)，則需通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該方法的建立有助于為中式臘肉中N-亞硝胺控制技術(shù)的研發(fā)提供方法支持。

將該方法用于市售樣品中N-亞硝胺水平的評(píng)估，結(jié)果表明，目前中式臘肉中8 種揮發(fā)性N-亞硝胺和總揮發(fā)性N-亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)水平均較低。但今后仍需對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)水平進(jìn)一步全面評(píng)估，包括增大樣本量、擴(kuò)大原料種類和產(chǎn)地的范圍等。目前國(guó)標(biāo)中僅規(guī)定了NDMA的限量要求，但市售樣品中還檢出了其他6 種揮發(fā)性N-亞硝胺，因此需增加標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)檢測(cè)的N-亞硝胺種類，尤其是補(bǔ)充總N-亞硝胺含量這一指標(biāo)。