趙麗麗，程菁菁，王趙改，史冠瑩，張 樂，王曉敏，蔣鵬飛，王旭增

（河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450000）

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Roem）為楝科香椿屬落葉喬木[1]，是我國重要的特產(chǎn)木本風味植物資源之一，已有2 300多年的栽培歷史[2]。香椿營養(yǎng)價值豐富，具有顯著的抗氧化、抑菌、抗癌及降血糖活性[3-9]。此外，香椿因其濃郁的特征香氣而備受青睞，其所含有的獨特揮發(fā)性成分是區(qū)別于其他蔬菜的關鍵，直接決定其食用價值、商品價值及產(chǎn)業(yè)前景[10]。河南為香椿的主栽產(chǎn)地，種植面積大，目前已在鄭州、中牟、登封、許昌、焦作、安陽、駐馬店、桐柏等地形成千畝基地近20 個，已發(fā)展成我省“富民工程”的現(xiàn)代特色農(nóng)業(yè)[11-12]。但受栽培地區(qū)土壤、氣候等多種因素影響，不同地區(qū)香椿特有風味存在差異，使其在深加工應用領域受到一定程度的限制[13-15]，故快速有效鑒定香椿揮發(fā)性成分并獲取其產(chǎn)地信息，客觀評價并控制其質(zhì)量是亟需解決的問題。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指紋圖譜是指樣品經(jīng)適當處理后，采用GC-MS檢測得到的，能夠標示樣品中各組分共有峰的圖譜[16]。該圖譜能夠?qū)⑹称分刑赜械膿]發(fā)性成分通過特定信息化處理，對食品進行分析識別，具有整體性、全面性和唯一性，可用于產(chǎn)品產(chǎn)地溯源、真假識別及質(zhì)量優(yōu)劣判別，目前已被廣泛應用于茶葉、蜂蜜、葡萄酒及其他食品的氣味識別研究[17-18]。龍立梅等[19]采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）與GC-MS聯(lián)用技術，建立不同等級信陽毛尖茶GC-MS指紋圖譜，為綠茶的品質(zhì)區(qū)分和分等定級提供了一種客觀量化的方法選擇；王華堂等[20]采用HS-SPME和GC-MS聯(lián)用法，分別建立蜂龍眼蜜和意蜂龍眼蜜揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜，為蜂蜜的科學評價提供參考；王紅廣等[21]采用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用技術，構建山西老陳醋香氣的GC-MS指紋圖譜，并借助聚類分析結(jié)合香氣風味特性分析實現(xiàn)了對山西老陳醋的身份識別。

化學模式識別技術是利用統(tǒng)計學、信號處理、數(shù)學算法等工具，從化學量測數(shù)據(jù)推理出物質(zhì)類的本質(zhì)屬性，進而對物質(zhì)進行識別和歸類的一門技術[22]。其能夠較好地迎合指紋圖譜整體性和模糊性的要求，分為無監(jiān)督模式識別方法和有監(jiān)督模式識別方法2 類[23-24]。無監(jiān)督模式識別是指在無樣品類別信息的情況下，進行學習或訓練，獲取分類信息的方法；有監(jiān)督模式識別則是根據(jù)樣品特征和已知類別的樣品（訓練集），用特定的方法或模型進行學習或訓練，從而建立分類模型，再根據(jù)獲取的分類模型和未知樣品的特征，對未知樣品進行 分類[25]。其中無監(jiān)督的模式識別方法包括聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等。有監(jiān)督的模式識別方法包括簇類獨立軟模式法、判別分析、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等[25]。目前，化學模式識別技術已被應用于中藥及食品質(zhì)量控制方面。青旺旺等[26]采用GC指紋圖譜結(jié)合化學模式識別，實現(xiàn)了20 批沉香化氣片的區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)造成不同批次樣品差異的主要標記物，為科學評價與有效控制沉香化氣片的質(zhì)量提供了可靠參考。蔡瑋琦等[27]采用高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學模式識別技術，將紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖進行有效區(qū)分，并找到了主要差異性成分。然而，目前國內(nèi)外鮮見使用GC-MS指紋圖譜技術結(jié)合化學模式識別（PCA及CA）進行香椿產(chǎn)地溯源的研究。

本研究擬以河南省不同地域來源的香椿嫩芽為對象，采用HS-SPME-GC-MS技術，首次將“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”引入香椿復雜風味體系，構建香椿揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜，并結(jié)合化學模式識別分析，以期探索和建立一種判別香椿地理源的方法，為香椿的快速溯源、品質(zhì)控制和食品安全提供一定的理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

17 批次香椿樣品分別取自河南省8 個不同地區(qū)不同采收期，其中S1～S16 16 批次香椿樣品主要用于GC-MS指紋圖譜的構建及化學模式識別，S17樣品用于方法驗證，其具體產(chǎn)地和采集時間見表1；液氮購自鄭州博越商貿(mào)股份有限公司。

表1 香椿樣品的來源Table 1 Sources of T. sinensis samples tested in this study

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、HS-SPME裝置（包括手持式手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、20 mL帶硅膠墊棕色頂 空瓶） 美國安捷倫公司；ME204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA A11液氮研磨機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME條件

取新鮮香椿，添加適量液氮，使用液氮研磨機進行粉碎。準確稱?。?.00±0.003）g于20 mL帶有硅膠墊的棕色頂空瓶中，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取頭距離樣品約1 cm，萃取30 min后取出萃取頭，插入GC-MS進樣口解吸5 min，同時開始采集保留時間和色譜峰強度等相關數(shù)據(jù)。

1.3.2 GC-MS聯(lián)用條件

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫40 ℃，保持3 min， 以5 ℃/min速率升溫至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電子電離源；掃描方式為全掃描；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲3 min；質(zhì)量掃描范圍m/z40～800；檢索圖庫為NIST 08.LIB。

1.3.3 方法學考察

精密度實驗：取同一香椿供試樣品，按照1.3.2節(jié)條件，連續(xù)進樣3 次，計算各共有峰保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

重復性實驗：取同一香椿樣品，平行準備3 份供試樣品，按照1.3.2節(jié)條件，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

穩(wěn)定性實驗：取同一香椿供試樣品，按照1.3.2節(jié)條件，分別于第0、12、24小時進樣，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用標準圖譜進行檢索分析、定性；將相似度大于800的峰作為確認，用峰面積歸一法計算各組分的相對含量。8 個不同產(chǎn)地16 批香椿樣品的GC-MS分析結(jié)果，根據(jù)相對保留時間和峰面積選取共有峰，采用SPSS 19.0軟件進行CA和PCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察結(jié)果

精密度實驗結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.17%，峰面積的RSD均小于1.87%，表明儀器精密度良好。重復性實驗結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.24%，峰面積的RSD均小于5.11%，表明該方法重復性良好。穩(wěn)定性結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.13%，峰面積的RSD均小于2.02%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 香椿中揮發(fā)性成分的種類及相對含量

將從河南省8 個不同產(chǎn)地16 批次香椿嫩芽樣品中鑒別出的248 種揮發(fā)性成分進行分類匯總，發(fā)現(xiàn)香椿嫩芽樣品中的揮發(fā)性成分主要分屬于醇類、含硫類、萜烯類、萜烯類氧化物、醛類、烷烴類、酯類、酸類、酮類和其他類。其中含硫類的相對含量最高，達52.84%；萜烯類和醛類的相對含量次之，分別為20.91%和17.67%；其他類別揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量均小于3.5%（圖1）。

圖1 16 種香椿嫩芽中揮發(fā)性化合物的相對含量Fig. 1 Relative contents of volatile compounds in 16 samples of T. sinensis

2.3 指紋圖譜的構建及共有模式的建立

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)是通過數(shù)據(jù)處理軟件對多個中藥樣品指紋圖譜進行峰匹配，提取共有峰后，利用相似度判定指紋圖譜間的相似程度[28]。劉江等[24]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)指紋圖譜的建立，以色譜方法居多，且高效液相色譜和GC被認為是制訂指紋圖譜標準的理想方法，GC更是在分析揮發(fā)性組分方面具有優(yōu)勢。由于香椿具有類似于中藥的復雜體系，因此應用指紋圖譜技術可以有效表征香椿揮發(fā)性成分。

將河南不同產(chǎn)地16 批次香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的保留時間和峰面積數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（中國藥典委員會2004A版）”進行圖譜分析，以樣品S1的色譜峰為參照峰，時間寬度設為0.10 s。為提高相似度結(jié)果的可靠性，將多個共有色譜峰的保留時間校正后進行自動匹配，生成對照指紋圖譜（R）和16 批次香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的GC-MS標準指紋圖譜 （圖2），共確認出6 個共有峰，并通過NIST 08.LIB標準譜庫檢索，查閱相關文獻資料，鑒定出該6 個共有峰的化學組成（表2）。結(jié)果表明不同產(chǎn)地香椿嫩芽揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜共有峰的相對保留時間差別較小，RSD在0.01%～0.31%之間，說明16 批次香椿嫩芽樣品揮發(fā)性特征成分基本相同。但其共有峰的相對峰面積差別較大，RSD在33.71%～114.77%之間，表明16 批次香椿嫩芽揮發(fā)性物質(zhì)的主要特征成分含量差別較大，其主要受產(chǎn)地、生長期等條件影響，該結(jié)果與王曉敏[15]、 楊慧[29]等的結(jié)果一致。

圖2 16 批香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig. 2 GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds and reference fingerprints

表2 16 批香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜中 6 個共有峰鑒定結(jié)果Table 2 Identification of six peaks common to GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds

2.4 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（中國藥典委員會2004A版）”，以樣品S1的色譜圖作為參照圖譜，進行相似度評價，結(jié)果見表3，參照圖譜與其余15 批香椿嫩芽樣品圖譜相似度為0.198～0.992。樣品S2、S3與樣品S1最為接近，相似度大于0.99；樣品S6、S12、S14與樣品S1比較接近，相似度大于0.9；樣品S5、S7、S11、S13與樣品S1相似度大于0.8；樣品S9、S10、S16與樣品S1差異最大，相似度分別為0.198、0.495、0.512。因此，可以說明同一產(chǎn)地、同一采收期的香椿揮發(fā)性成分最相似，不同生長環(huán)境（高山、平原）的差異最顯著。

表3 共有模式下香椿嫩芽樣品的相似度評價結(jié)果Table 3 Similarity in volatile components among 16 batches of T. sinensis tender buds

2.5 化學模式識別

2.5.1 CA

CA法是一種常用的指紋圖譜技術質(zhì)量評價方法，對沒有樣本所屬類別信息的物質(zhì)，以分類圖形式進行直觀的系統(tǒng)分析，適用于對大批量樣品進行快速分類或身份識別[23]。將16 批香椿嫩芽樣品6 個共有峰的峰面積作為變量，得到16×6階原始數(shù)據(jù)，導入SPSS 19.0軟件進行CA，采用組間連接法，以歐氏距離平方為分類依據(jù)，相似度越大，2 個樣品之間的距離越近[30]。

如圖3所示，當類間距為25時，可將河南省不同產(chǎn)地16 批次香椿嫩芽揮發(fā)性成分聚為2 類，其中樣品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14聚為第1類，樣品S4、S8、S9、S10、S15、S16聚為第2類。對照表1發(fā)現(xiàn)，第1類樣品多為頭茬，且產(chǎn)地均為平原，因此很好地聚為1 類；第2類樣品多為二茬，且許昌、信陽2 個產(chǎn)地樣品均采自高山，因此聚為1 類。

圖3 香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的CA樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

當類間距為5時，根據(jù)第1類樣品之間的差異又可將其分為3 類，樣品S5、S7、S11、S12聚為1 類，均集中在河南東部地區(qū)；樣品S1、S3、S6、S13、S14為1 類，產(chǎn)地大多集中在河南西部地區(qū)；S2單獨聚為1 類。當類間距為8時，根據(jù)第2類樣品之間的差異可將其分為3 類，樣品S9、S10均采自高山地區(qū)，被聚為1 類；樣品S4、S8、S15，其中S4、S8均為平原栽種，采收期相同，被聚為1 類；樣品S16采自高山地區(qū)，單獨聚為1 類。以上分析結(jié)果表明，在河南范圍內(nèi)，采收期及產(chǎn)地（地理位置、海拔高度等）對香椿嫩芽揮發(fā)性成分具有顯著影響。朱永清等[31]同樣采用HS-SPME-GC-MS方法研究了“巴山紅”香椿芽葉5 個不同發(fā)育時期揮發(fā)性物質(zhì)的組成特征，結(jié)果表明在不同發(fā)育時期揮發(fā)性組分的種類及相對含量具有明顯差異；王曉敏等[15]亦采用HS-SPME-GC-MS方法發(fā)現(xiàn)河南4 個產(chǎn)地香椿揮發(fā)性風味物質(zhì)呈現(xiàn)明顯地域差異性。因此，本研究所得結(jié)果與文獻結(jié)果一致，且與相似度評價結(jié)果一致。

2.5.2 PCA

PCA是一種能夠?qū)⒍鄠€變量通過線性變換選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計方法[32]。以河南不同產(chǎn)地16 批香椿嫩芽樣品6 個共有峰的峰面積為變量形成16×6階數(shù)據(jù)，將該數(shù)據(jù)導入SPSS 19.0軟件中，選擇分析-降維-因子分析，在描述中選擇系數(shù)、顯著性水平和行列式，在旋轉(zhuǎn)中選擇最大方差法，輸出載荷圖，使用正交旋轉(zhuǎn)法進行PCA，得到前3 個PC的特征值分別為2.196、1.630、1.050（均大于1），累計方差貢獻率達81.257%，超過80%，說明前3 個PC綜合了16 批香椿樣品揮發(fā)性成分的絕大部分原始變量信息，能代表樣品揮發(fā)性成分的主要特征（表4）。如圖4所示，以空間散點的距離分，樣品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14的PC相較于其他樣品較為相近，聚為1 類；樣品S4、S8、S9、S10、S15、S16的PC較為相近聚為第2類，不同樣品的揮發(fā)性成分之間存在明顯差異，PCA可將河南不同產(chǎn)地香椿進行有效區(qū)分，該結(jié)果與相似度評價及CA結(jié)果一致。

表4 PC總方差解釋Table 4 Eigenvalues and contributions to total variance of PC

圖4 香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的PCA得分圖Fig. 4 PCA score plot of volatile components in T. sinensis buds

PCA載荷反映了各變量對PC的貢獻大小和貢獻方向，其絕對值越大，表明該變量對PC的貢獻越大，正負反映方向[33]。如圖5所示。在PC1上，共有物質(zhì)2-己烯醛具有較高的正載荷，2,4-二甲基噻吩有較高的負載荷，說明PC1反映2-己烯醛和2,4-二甲基噻吩提供得到的綜合信息。含硫類物質(zhì)一般具有較低的感知閾值（能夠感覺到有氣味的最小濃度）和較強的氣味，呈現(xiàn)出類似于大蒜、韭菜、洋蔥等刺激性氣味[34]，2,4-二甲基噻吩可能是由雙(1-丙烯基)二硫化物在經(jīng)過高溫加熱后首先轉(zhuǎn)化 為2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩，再進一步加熱降解所得[35-36]。醛類也是構成香椿主要香氣特征的一大類 物質(zhì)[34]。Yang Wenxi[37]和Zhai Xiaoting[38]等采用分子感官技術均發(fā)現(xiàn)雙(1-丙烯基)二硫化物、己醛、反-2-己烯醛等為構成新鮮香椿獨特氣味的主要貢獻化合物。在PC2上，共有物質(zhì)乙酸法呢醇酯表現(xiàn)出較高的正載荷，說明PC2反映乙酸法呢醇酯提供得到的信息。同理，PC3反映2-甲基-3-亞甲基-環(huán)戊烷甲醛提供得到的信息，表現(xiàn)出較高的正載荷。由此可以說明，2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亞甲基-環(huán)戊烷甲醛是造成河南省不同產(chǎn)地不同采收期香椿嫩芽樣品中揮發(fā)性成分差異顯著的主要物質(zhì)。2-己烯醛、2-甲基-3-亞甲基-環(huán)戊烷甲醛賦予香椿青香和草香，2,4-二甲基噻吩賦予香椿硫磺及蒜臭類辛辣刺激性氣味，乙酸法呢醇酯賦予香椿花香，共同對香椿嫩芽的整體風味起重要貢獻作用[39]。

圖5 香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的PCA載荷圖Fig. 5 PCA loading plot of volatile components in T. sinensis buds

通過累計方差貢獻率提取的3 個PC為綜合評價指標，計算得到河南省16 批香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的PC得分及綜合得分見表5。由表5可知，S16、S15香椿樣品的揮發(fā)性成分綜合得分最高。由于香椿獨特揮發(fā)性成分是決定香椿品質(zhì)的關鍵影響因素，從香椿風味的角度，可以說明信陽高山栽種的香椿嫩芽品質(zhì)最優(yōu)，這可能是由于信陽高山氣候、土壤因子以及植被等綜合天然生態(tài)條件較適合香椿生長的緣故。因此，在選擇加工原料來源時，可根據(jù)產(chǎn)品要求選擇適宜產(chǎn)地取材。

表5 標準化后PC綜合得分Table 5 Comprehensive scores of PC after standardization

2.6 方法驗證

基于本實驗建立的河南不同產(chǎn)地香椿揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜及化學模式識別分析，將采集到的駐馬店三茬香椿樣品（編號S17）揮發(fā)性成分6 個共有物質(zhì)的GC-MS色譜峰峰面積數(shù)據(jù)代入SPSS 19.0軟件進行CA。如圖6所示，樣品S17、S11、S12明顯聚為1 類，說明樣品S17與樣品S11、S12歸屬于同一產(chǎn)地，能夠快速確定樣品S17來源于河南駐馬店。因此本實驗建立的GC-MS指紋圖譜結(jié)合化學模式識別方法對于河南不同產(chǎn)地香椿樣品的快速溯源具有較強的指導意義和實用參考價值。

圖6 香椿嫩芽樣品揮發(fā)性成分的CA樹狀圖Fig. 6 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

3 結(jié) 論

本實驗將“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”引入香椿復雜風味體系中，構建了河南省8 個不同產(chǎn)地16 批次香椿嫩芽揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜，共確定出6 個共有峰，并鑒定出其化學成分分別為2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、2-甲基-3-亞甲基-環(huán)戊烷甲醛、β-紫羅蘭酮、1-氧阿司匹林[2.5]辛烷.5-5-二甲基-4-(3-甲基-1,3-丁二烯)、乙酸法呢醇酯。

根據(jù)中藥指紋圖譜相似度評價結(jié)果結(jié)合共有成分CA、PCA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)河南省內(nèi)不同產(chǎn)地、采收期的香椿嫩芽揮發(fā)性成分存在較大的差異。不同產(chǎn)地和采收期對香椿嫩芽揮發(fā)性成分影響顯著，同一生長期采收的樣品被很好地聚為一類，東部和西部、高山和平原栽種的樣品也能被很好地區(qū)分開。此外，PCA找到了引起不同批次香椿嫩芽樣品間風味差異的主要成分為2-己烯醛、 2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亞甲基-環(huán)戊烷甲醛，同時發(fā)現(xiàn)信陽高山種植的香椿揮發(fā)性成分綜合得分最高。最后通過CA對未知產(chǎn)地香椿進行歸類，能夠快速鑒定出其產(chǎn)地來源。以上結(jié)果表明GC-MS指紋圖譜結(jié)合化學模式識別能夠明確不同生長期、不同地域香椿品質(zhì)的差異，找出對香椿風味具有貢獻的特征香氣成分，為香椿的快速溯源、品質(zhì)監(jiān)控和食品安全供應提供一定的理論基礎和技術支撐。