傅利軍，劉 莉，張秀敏，馬永征，孫 勇,，岳 甜，徐明芳,

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

食用菌是一類口感鮮美、營養(yǎng)豐富且具有食藥用價值的大型子實體真菌，它不僅具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇和富含8 種人體必需氨基酸等特點[1]，還含有多種生理活性物質(zhì)，包括多糖、酚類、倍半萜、超氧化物歧化酶和甾醇類[2]等，幫助機(jī)體發(fā)揮抗炎、抗癌、抗氧化、抑菌、肝保護(hù)、降血糖和抗糖尿病等作用[3-4]，適合于各類人群包括免疫力低下、老年人和糖尿病患者等食用，是公認(rèn)的綠色健康食品。食用菌富含甾醇類，其中包括麥角固醇。麥角固醇是食用菌細(xì)胞膜的重要組成部分，在維持食用菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整和功能正常運(yùn)行方面起著重要作用，也可作為工業(yè)用生產(chǎn)醫(yī)藥類產(chǎn)品[5]。麥角固醇也是麥角鈣化甾醇（VD2）的光轉(zhuǎn)化前體。食用菌通過紫外光照處理異構(gòu)化轉(zhuǎn)化為VD2，得到的富VD2食用菌經(jīng)由膳食途徑攝入，可預(yù)防和治療因VD2缺乏或不足產(chǎn)生的兒童軟骨病、佝僂病和老人骨質(zhì)疏松癥等，是人體獲取VD2的良好途徑。

麥角固醇和VD2的定量檢測方法目前已得到廣泛研究，多見于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-7]、氣相色譜法[8]以及各種聯(lián)用技術(shù)[9]等精確定量方法。定量核磁共振波譜（quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy，qNMR）是一種近年來新興的定量檢測方法，它是1935年核磁共振現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來并用于結(jié)構(gòu)定性方面的進(jìn)一步發(fā)展。其定量基本原理是根據(jù)Bloch方程，即核磁譜圖中粒子吸收峰峰面積只與待測組分所包含的粒子數(shù)呈正比，通過積分譜圖目標(biāo)特征信號峰，即能獲得待測組分的含量。目前，隨著磁場強(qiáng)度的提高、超低溫碳頭的出現(xiàn)，其檢測的靈敏度、精確度逐漸得到提高，qNMR在食品[10-13]、藥品[14-15]、生物[16]、代謝組學(xué)[17-19]和化合物純度檢測[20-22]等方多面得到了廣泛應(yīng)用。如劉曉婷等[23]建立固相萃取-qNMR測定板藍(lán)根飲片中的表告依春含量的方法，得出方法的精密度小于1%，可用于低含量復(fù)雜樣品的定量分析；Tanja等[24]利用核磁共振定量研究當(dāng)歸藥材有效成分，利用反相固相萃取將當(dāng)歸活性濃縮成單個組分，再通過堿性磷酸酶、（抗）雌激素活性和細(xì)胞毒性實驗，建立了定量1H-NMR（qHNMR）方法，對當(dāng)歸內(nèi)酯等活性組分進(jìn)行了鑒定和定量，并建立了真實當(dāng)歸制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Canela-Garayoa等[25]采用單一核磁共振研究生物催化合成乙基脂肪酸酯，檢測結(jié)果與氣相色譜法結(jié)果一致。qNMR是一種無損檢測技術(shù)，對測樣品純度要求不高，樣品預(yù)處理步驟簡單，可用于復(fù)雜混合物的定量分析，專屬性強(qiáng)，一定程度上彌補(bǔ)了常規(guī)色譜檢測方法的局限性。隨著美國、日本和歐洲藥典相繼將qNMR收載以及我國藥典的收錄，其在全世界范圍內(nèi)已被作為一種標(biāo)準(zhǔn)測定方法得以應(yīng)用。

目前核磁定量方法用于食用菌樣品檢測主要集中在食用菌三萜類[26]、苯類[27]化合物定量的檢測，對于食用菌中麥角固醇的定量檢測鮮見報道。本研究將選擇C-18H質(zhì)子單峰作為麥角固醇的目標(biāo)定量特征峰，建立食用菌麥角固醇的定量檢測方法，探討定量檢測麥角固醇的可行性，旨在彌補(bǔ)qNMR在檢測食用菌麥角固醇方面的空白，為食用菌的新產(chǎn)品研發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供理論依據(jù)與技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

每包100 g共3 包食用菌（雞油菌、茶樹菇、蟲草）干品購自云南文山農(nóng)貿(mào)市場，陰涼干燥玻璃罐儲存?zhèn)溆谩?/p>

麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品（CAS57-87-4）、VD2標(biāo)準(zhǔn)品（CAS50-14-6） 美國Sigma公司；氘代氯仿（99.8%，含TMS） 上海麥克林生化科技有限公司；吡嗪（99%） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（≥99.7%）、石油醚（60～90 ℃） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、甲醇（均為優(yōu)級純） 西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avance III 600 MHz型超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國 Bruker公司；5 mm核磁管帶壓力帽（WG-1000-7） 美國Wilmad公司；1100型液相色譜儀 美國Agilent 科技有限公司；CP224C電子天平 奧豪斯儀器有限公司；ER-182A型電子分析天平 日本AND公司； SB25-12D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DGX-9143B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取一定質(zhì)量的麥角固醇和內(nèi)標(biāo)物吡嗪，溶于一定體積的氘代氯仿溶液中，混合均勻，取一定體積轉(zhuǎn)入核磁管，待測。

1.3.2 供試品的制備

取食用菌子實體干品適量，研磨，稱取0.5 g置于250 mL磨口燒瓶中，加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的NaOH溶液、25 mL無水乙醇，混勻后85 ℃皂化回流2.5 h，取出冷卻、過濾，加入25 mL的石油醚，劇烈振蕩15 min，靜置1 h，重復(fù)操作1 次，合并上層萃取液，水洗2 次，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸盡石油醚，如此重復(fù)5 次實驗制備樣品，取5 mL氘代氯仿定容。測定前使用0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.31H-NMR和HPLC檢測條件

1H-NMR實驗中采用的共振頻率為600.18 MHz；脈沖序列zg 30；脈沖寬度9.64 μs；檢測溫度25 ℃；空掃次數(shù)2 次；中心頻率2 769.83 Hz，譜寬為δ 20.026 0；接收增益124。

HPLC檢測條件：1100液相色譜儀，C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為水；洗脫條件：0～2 min，10% A，90% B；2～3 min，100% A，0% B；3～5 min，90% A，10% B。進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長270 nm。

1.3.4 核磁共振法定量檢測麥角固醇的參數(shù)優(yōu)化

配制一定質(zhì)量濃度麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行弛豫延遲時間、采集時間和掃描次數(shù)的考察。設(shè)置弛豫延遲時間梯度為5、10、15、20、30、50 s，采集時間梯度為2、3、4、5、6 s，掃描次數(shù)為32、64、128、256、320，按設(shè)置值從小到大進(jìn)行核磁實驗，以目標(biāo)特征峰的峰面積值作為參考，保證其穩(wěn)定不再變化。

1.3.5 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品1.1、2.1、3.1、4、5.3 mg，按由低到高次序分別精密加入1.2、1.2、1.2、0.6、0.6 mg的內(nèi)標(biāo)物吡嗪，精準(zhǔn)吸取1 mL的氘代氯仿溶液分別溶解，溶解完全后分別準(zhǔn)確吸取0.6 mL轉(zhuǎn)入核磁管進(jìn)行核磁檢測，以麥角固醇和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比作為橫坐標(biāo)，兩者的目標(biāo)特征峰峰面積比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 定量核磁共振氫譜檢測麥角固醇方法學(xué)考察

1.3.6.1 檢出限和定量限

2020年《中華人民共和國藥典》（第四版）規(guī)定，核磁共振的檢出限和定量限RSN分別為3和10。英國藥典規(guī)定核磁定量方法的定量限RSN需不小于150。本研究取RSN中較大值作為定量限標(biāo)準(zhǔn)。

實驗時精密稱取麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品，精確到0.1 mg，氘代氯仿溶液溶解、稀釋，配制為不同質(zhì)量濃度的麥角固醇溶液，按照質(zhì)量濃度從高到低順序進(jìn)行核磁掃描檢測，以核磁處理軟件自帶的RSN計算方法進(jìn)行麥角固醇目標(biāo)特征定量峰的RSN計算，分別確定RSN為150和3條件下的麥角固醇質(zhì)量濃度作為定量限和檢出限。

1.3.6.2 精密度實驗

稱取麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物吡嗪適量，配制一份麥角固醇和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在核磁優(yōu)化條件下連續(xù)掃描5 次。

1.3.6.3 重復(fù)性實驗

精密稱取麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物吡嗪適量，取氘代氯仿混合溶解完全，配制為6 份相同質(zhì)量濃度的麥角固醇內(nèi)標(biāo)混合溶液，轉(zhuǎn)入核磁管，分別在同等優(yōu)化條件下掃描。

1.3.6.4 穩(wěn)定性實驗

精密稱取麥角固醇和內(nèi)標(biāo)物吡嗪適量，取氘代氯仿混合溶解完全，室溫放置，在優(yōu)化后的核磁條件下分別于0.0、6.5、23.5、30.5、48.0 h檢測。

1.3.6.5 加標(biāo)回收實驗與計算

精密稱取一定質(zhì)量的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和吡嗪內(nèi)標(biāo)物，配制為一定質(zhì)量濃度的麥角固醇與內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液作為加標(biāo)原溶液；精密稱取一定質(zhì)量的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品，配制為高質(zhì)量濃度的麥角固醇加標(biāo)液，分別取一定體積精密加標(biāo)3 份原溶液，加標(biāo)量分別計算標(biāo)定為1.228 1、2.017 5、2.719 3 mg，混勻后各取0.6 mL核磁檢測。按式（1）計算加標(biāo)回收率：

1.3.7 檢測樣品中麥角固醇

稱取2.5 g食用菌樣品粉末，按1.3.2節(jié)方法提取麥角固醇，溶于25 mL無水乙醇后取出0.5 mL用于HPLC檢測進(jìn)行對比，其余旋轉(zhuǎn)蒸干后加入5 mL 0.02 mg/mL的吡嗪氘代氯仿溶液溶解，檢測樣品中麥角固醇含量。

1.3.8 譜圖處理

1.3.8.1 譜圖的校正、定標(biāo)與積分

采用MestReNova 9.0軟件進(jìn)行核磁圖譜的定標(biāo)和積分處理。點擊MestReNova 9.0軟件工具欄的“基線校正”，選擇伯恩斯坦多項式擬合方法進(jìn)行基線校正；選擇工具欄的“相位校正”，定位擬調(diào)整相位峰，點擊鼠標(biāo)左鍵調(diào)節(jié)其相位為零級相位校正；調(diào)整特定的峰，點擊鼠標(biāo)右鍵調(diào)節(jié)其他遠(yuǎn)端峰相位為一級相位校正。

完成基線和相位校正后，以氘代氯仿溶劑峰進(jìn)行定標(biāo)；點擊工具欄的“參考”，選擇化學(xué)位移δ 7.2峰，標(biāo)峰時將化學(xué)位移更改為δ 7.26，對譜圖上其他峰逐個標(biāo)峰。

積分時放大譜圖，取峰信號與基線剛好重疊處為起止點，固定積分區(qū)間，內(nèi)標(biāo)物吡嗪信號峰積分區(qū)間約為δ 8.57～8.63，麥角固醇目標(biāo)定量峰C-18H積分區(qū)間約為δ 0.60～0.66，確保積分的重復(fù)性良好。圖譜處理時手動進(jìn)行相位校正和基線校正，對內(nèi)標(biāo)物和樣品的定量峰分別進(jìn)行5 次積分，取其平均值，得到積分結(jié)果。

1.3.8.2 多重峰分析

選擇MestReNova 9.0核磁處理軟件進(jìn)行多重峰分析，批量處理已標(biāo)定、積分完畢的峰，得到包含峰化學(xué)位移、峰等級（單/雙峰/多重峰）和氫質(zhì)子數(shù)等信息的譜圖分析結(jié)果。

1.3.8.3 RSN的計算

采用MestReNova 9核磁處理軟件，點擊譜圖，基線與相位校正后，對擬處理目標(biāo)峰進(jìn)行化學(xué)位移標(biāo)定，在譜圖上選擇一段平滑的基線區(qū)域計算噪聲區(qū)，根據(jù)需要的信號范圍，采用軟件工具欄中SNR Peak Calculator自動計算出標(biāo)定的目標(biāo)峰RSN。

1.3.8.4 線性擬合

采用Topspin 3.6.2軟件工具欄中“Start Fit”進(jìn)行核磁的線性擬合，將擬合后的譜圖在MestReNova 9.0中進(jìn)行常規(guī)積分，獲得去除雜質(zhì)峰干擾后的樣品定量檢測峰積分結(jié)果。

1.3.9 計算公式

定量核磁的基本原理是圖譜中信號響應(yīng)值（即峰面積WX）與待測物（如質(zhì)子，NX）數(shù)目呈正比，而與待測物的化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，一般只要對該化合物中某一基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積進(jìn)行比較，即可求出其絕對含量。對目標(biāo)信號積分，按照1H-NMR內(nèi)標(biāo)法，依據(jù)式（2）定量，計算食用菌中麥角固醇的含量：

式中：MX和MY分別為待測物和內(nèi)標(biāo)物的相對分子質(zhì)量；m為測定混合物樣品的質(zhì)量/mg；mY和PY分別為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量/mg和純度；NX/NY和WX/WY分別為圖譜中待測物目標(biāo)峰及內(nèi)標(biāo)對應(yīng)核的個數(shù)及峰面積。

HPLC檢測的麥角固醇含量按式（3）計算：

式中：C為麥角固醇質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品定容體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為萃取時樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Origin 8、Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H-NMR氘代溶劑和內(nèi)標(biāo)物的選擇

氘代氯仿試劑在核磁共振波譜分析中起溶解樣品和信號鎖場的雙重作用，氘代氯仿試劑必須對樣品和內(nèi)標(biāo)物溶解性都非常好，不會導(dǎo)致譜圖信號重疊。麥角固醇作為小分子物質(zhì)，相對分子質(zhì)量為396.65，均可溶于乙醇、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，其中在氘代氯仿中兩者溶解度均較大，麥角固醇達(dá)到32.258 1 g/L， 且氘代氯仿較經(jīng)濟(jì)易得，因此選擇氘代氯仿作為溶劑。吡嗪（對二氮雜苯）在其2、3、5、6位上含有4 個等價氫，相對分子質(zhì)量為88.088，易溶于乙醇、乙醚、氯仿和水，是核磁定量實驗中常見的內(nèi)標(biāo)物。稱取麥角固醇、吡嗪，以氘代氯仿充分溶解，取0.6 mL核磁檢測，以溶劑對照，結(jié)果如圖1所示。

如圖1A所示，氘代氯仿溶劑峰在δ7.26處出現(xiàn)，四甲基硅烷在δ0.0峰，在核磁共振波譜的1H、13C和29Si譜中起到標(biāo)定化學(xué)位移零點的作用；根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在選定氘代氯仿溶劑中的溶解性和MestReNova軟件模擬內(nèi)標(biāo)物和待測樣品的核磁氫譜，內(nèi)標(biāo)物吡嗪在出峰位與待測樣品的譜峰沒有重疊，與定量峰的間距也較為合理，圖1B中，麥角固醇的信號峰在δ0～5.6之間，與氘代氯仿峰（δ7.26）互不干擾可選作溶劑。由圖1C對比顯示，內(nèi)標(biāo)物吡嗪在δ8.60處出峰，吡嗪對目標(biāo)物麥角固醇的峰信號互不產(chǎn)生干擾，且不干擾樣品的定量峰，在氘代氯仿中能較好地溶解，可選吡嗪為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量實驗。

圖1 氘代氯仿（A）、麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品（B）、麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品與 內(nèi)標(biāo)物吡嗪的混合（C）圖譜Fig. 1 NMR spectra of deuterated chloroform (solvent blank) (A), ergosterol standard (B), and a mixture of ergosterol and pyrazine standard (C)

2.2 核磁檢測食用菌麥角固醇檢測體系的建立

2.2.1 麥角固醇分子結(jié)構(gòu)信號峰歸屬

以氘代氯仿作為溶劑，配制麥角固醇的溶液，于600 MHz核磁儀器上檢測，其質(zhì)子信號峰歸屬情況 見表1、圖2。

少女將寬大的滑翔翼丟在地上。下落時狂烈的山風(fēng)，吹落了她束縛頭發(fā)的皮繩，她那深栗色的卷發(fā)，此刻正雜亂地披散在肩上，隨著風(fēng)輕輕鼓蕩，像狂野的浪。大大的眼睛黑而深邃，淺棕色的皮膚，精瘦緊俏的臉頰，飽滿緊致的雙唇，透露著一種野性的美感。她怒氣沖沖地走過來，劈頭蓋臉地罵道：“你這個笨蛋！你不要命了嗎！”

圖2 麥角固醇質(zhì)子信號峰歸屬Fig. 2 Assignment of ergosterol proton signal peaks

表1 麥角固醇的質(zhì)子信號峰歸屬Table 1 Assignment of ergosterol proton signal peaks

從表1可知，在化學(xué)位移δ0.63處C-18H與δ0.94處 C-19H為單峰外，其余質(zhì)子峰均為雙峰或混峰，對于待測物及內(nèi)標(biāo)，均應(yīng)盡量選擇含多個原子的孤立尖銳單峰作為定量峰，以保證有足夠的積分范圍。

2.2.2 食用菌麥角固醇目標(biāo)定量峰的確定

采用1H-NMR進(jìn)行定量時，應(yīng)對被測樣品中的各個質(zhì)子信號進(jìn)行歸屬，明確每個信號峰所對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)，選擇合適的信號峰作為定量特征峰[28]。配制不同質(zhì)量濃度麥角固醇與內(nèi)標(biāo)物吡嗪的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，常規(guī)檢測條件下檢測，以內(nèi)標(biāo)定量法進(jìn)行核磁檢測結(jié)果計算，與理論質(zhì)量進(jìn)行對比，觀察質(zhì)子峰峰面積與麥角固醇上樣量的相關(guān)性。計算結(jié)果如表2所示。

表2 麥角固醇的質(zhì)子信號峰定量驗證 Table 2 Quantitative verification of proton signal peaks of ergosterol

表2結(jié)果顯示，δ0.63質(zhì)子單峰相比δ0.95和δ1.02～1.05處單峰和雙峰的計算結(jié)果與理論值誤差更小。定量質(zhì)子特征峰應(yīng)基線穩(wěn)定能實現(xiàn)基線分離，如圖3所示，譜圖中能實現(xiàn)基線分離的質(zhì)子信號峰分別僅有處于高場區(qū)δ0.63（單峰）和δ1.04（雙峰），盡管δ0.95處的質(zhì)子單峰在一定條件下檢測積分相對穩(wěn)定，但受右側(cè)2 個雙峰影響，信號峰基線不穩(wěn)未能實現(xiàn)基線分離，無法作為定量特征峰。

圖3 核磁檢測雞油菌（A）、茶樹菇（B）樣品和麥角固醇 標(biāo)準(zhǔn)品（C）譜圖及局部圖（D）Fig. 3 NMR full spectra of chanterelle (A), Agrocybe aegerita (B) and ergosterol standard (C) and partial enlarged spectra (D)

通過麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和食用菌樣品譜圖的放大對比，食用菌樣品中存在的復(fù)雜基質(zhì)均對δ0.95和δ1.04的信號峰產(chǎn)生不同程度的干擾，均無法成為定量目標(biāo)峰，如圖3所示。

核磁定量中優(yōu)先選擇單峰作為定量峰，放大δ0.63的單峰觀察，干擾δ0.63單峰，主要是在其右側(cè)形成一個信號相對較弱且不能與主峰基線分離的小峰，如圖4b所示，采用核磁譜圖處理軟件（Bruker TopSpin軟件）去卷積處理方法，可對目標(biāo)峰進(jìn)行線性擬合，擬合后單獨積分，進(jìn)而排除雜質(zhì)峰對主峰的積分干擾，最終確定選擇C18甲基質(zhì)子單峰C-18H（s）為定量目標(biāo)峰，通過峰面積積分對樣品中麥角固醇進(jìn)行定量。

圖4 化學(xué)位移δ0.63單峰與δ 1.04雙峰處信號峰放大圖譜Fig. 4 Spectral amplification of signal peak at δ 0.63 and double peaks at δ 1.04

2.3 1H-NMR檢測麥角固醇條件的優(yōu)化

2.3.1 弛豫延遲時間

弛豫過程分為自旋-晶格弛豫（縱向弛豫）和自旋-自旋弛豫（橫向弛豫），自旋-晶格弛豫是指處于高能態(tài)的核自旋體系將能量傳遞給周圍環(huán)境（晶格或溶劑），自身回到低能態(tài)的過程，所需時間為自旋-晶格弛豫時間，也稱縱向弛豫時間T1，縱向弛豫反映了自旋體系與環(huán)境之間的能量交換。通常弛豫時間的長短對核磁定量分析很重要，是定量核磁中非常重要的一個參數(shù)，弛豫時間較短會影響定量核磁的精密度和準(zhǔn)確度，足夠的弛豫時間能確保已激發(fā)的原子有充足時間恢復(fù)到基態(tài)并再次激發(fā)，從而使信號多次采集并積累，提高靈敏度。

核磁實驗中確定弛豫延遲時間，通過設(shè)置不同弛豫延遲時間梯度，按時間從小到大進(jìn)行實驗，對比峰面積值，當(dāng)峰面積值基本不再變化時，表明達(dá)到弛豫延遲時間不小于5Tl要求。研究中采用這個方法進(jìn)行弛豫延遲時間的確定[30]。配制麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，掃描次數(shù)128，采樣時間4 s，其他條件確定下進(jìn)行弛豫延遲時間的優(yōu)化，麥角固醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的結(jié)果如表3所示。

表3 弛豫延遲時間的優(yōu)化Table 3 Optimization of relaxation delay time

如表3所示，固定積分范圍積分，同一份樣品分別在不同弛豫時間下掃描，隨著延遲時間的延長，峰面積比逐漸下降，到15 s之后，下降趨勢減緩穩(wěn)定，選擇15 s作為最佳的弛豫延遲時間。

2.3.2 采集時間

采集時間與譜圖的數(shù)字分辨率有很大的關(guān)系，兩者互為倒數(shù)關(guān)系，即采集時間越長，則分辨率越小，采集時間選擇范圍一般為2～4 s[31]，自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號經(jīng)過傅里葉變換才能轉(zhuǎn)換成可看譜圖，如果采集時間小于信號完全衰減成噪音的時間，F(xiàn)ID信號將被截尾，截尾作用會把假信號帶進(jìn)譜圖，使譜圖發(fā)生畸變。若采集時間大于完全衰減成噪音的時間，則會因為采集到更多的噪音而降低譜圖的分辨率。探討與優(yōu)化合適的采集時間，保證FID信號衰減完全，提高儀器的使用效率。

在優(yōu)化的弛豫延遲時間15 s條件下，設(shè)置掃描次數(shù)為128 次，時間梯度為2、3、4、5、6 s，優(yōu)化采樣時間，結(jié)果如表4所示。

表4 采集時間的優(yōu)化 Table 4 Optimization of acquisition time

在2～6 s的采集時間中，隨著采集時間的延長，峰面積比值在0.3、0.2處穩(wěn)定波動，為節(jié)約實驗時間，后續(xù)實驗選擇2 s作為最優(yōu)采集時間。

2.3.3 掃描次數(shù)

核磁定量實驗中，為獲得高信噪比的譜圖，一般通過加大樣品的上樣量或在樣品量較少時增加掃描次數(shù)獲得。在上樣量一定時，較少的掃描時間內(nèi)，數(shù)據(jù)的重復(fù)性較差，增加掃描次數(shù)，數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，譜圖信噪比高，得到平滑的譜圖，但會延長占機(jī)時間，需要確定適合的掃描次數(shù)。設(shè)置采集時間2 s、弛豫延遲時間15 s，設(shè)掃描次數(shù)分別為32、64、128、256、320，優(yōu)化掃描次數(shù)，結(jié)果如表5所示。

表5 掃描次數(shù)的優(yōu)化 Table 5 Optimization of number of scans

由表5可知，峰面積比值首先隨著掃描次數(shù)的增加而下降，此時數(shù)據(jù)的重復(fù)性較差，到256 次時緩慢增加并基本趨于穩(wěn)定，此時數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，重復(fù)性好?？紤]為獲得更高的信噪比，故選擇256 次作為最佳的掃描次數(shù)。

2.4 1H-qNMR檢測麥角固醇質(zhì)量濃度線性比例關(guān)系

配制不同質(zhì)量濃度的麥角固醇和吡嗪混合溶液，在優(yōu)化后的條件下核磁檢測。設(shè)置麥角固醇質(zhì)量為Wx，吡嗪質(zhì)量為WIS，麥角固醇峰面積為Ax，內(nèi)標(biāo)物吡嗪峰面積為AIS。以麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比作為橫坐標(biāo)，麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。麥角固醇與內(nèi)標(biāo)物吡嗪質(zhì)量比為0.55～5.30 mg/mg范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y=0.130 6X+0.008 3，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999 7，表明線性關(guān)系良好，能滿足核磁定量需要。

2.5 1H-qNMR檢測麥角固醇方法的評價

2.5.1 檢出限和定量限結(jié)果

樣品測定時，根據(jù)中國藥典和英國藥典對qNMR要求（RSN≥150）。在一定硬件條件下，樣品濃度無法改變時，可以通過增加或累積掃描次數(shù)增加信號強(qiáng)度從而提高RSN。但是掃描次數(shù)并不是越多越好，太多的掃描次數(shù)無疑延長了測定時間。以核磁處理軟件自帶的RSN計算方法進(jìn)行麥角固醇目標(biāo)特征定量峰的RSN計算，分別確定RSN為150與3條件下的麥角固醇質(zhì)量作為定量限和檢出限，結(jié)果如表6所示。

表6 核磁麥角固醇質(zhì)量與信噪比Table 6 Ergosterol concentration and corresponding signal to noise ratio

如表6所示，在0.6 mL的氘代溶液中，當(dāng)麥角固醇質(zhì)量濃度為0.001 8 mg/mL時，RSN為4.29，確定為檢出限；當(dāng)麥角固醇質(zhì)量濃度為0.005 3 mg/mL時，RSN為14.25，可作為其定量限。

根據(jù)英國藥典規(guī)定，核磁氫譜定量方法若達(dá)到精確定量，RSN應(yīng)不小于150，在麥角固醇質(zhì)量濃度為0.045 0 mg/mL時，RSN為154.05，故為保證核磁定量精確度，確定最終定量限為0.045 0 mg/mL。

2.5.2 方法精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性分析

在核磁優(yōu)化實驗條件下，日內(nèi)掃描5 次分析儀器的精密度；精密稱取麥角固醇和吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度相等的6 份溶液，并在0.0、6.5、23.5、31.0、48.0 h條件下核磁檢測，結(jié)果如表7所示。

表7 儀器精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測Table 7 Evaluation of instrumental precision, repeatability and stability

從表7可知，日內(nèi)掃描5 次的峰面積比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.224 2%，6 份重復(fù)樣品的檢測結(jié)果RSD為3.82%，以峰面積法定量時，0.0～6.5 h內(nèi)峰面積比變化較小，RSD為0.392 1%；0.0～23.5 h內(nèi)，RSD為1.550 6%；0～48 h內(nèi)的RSD為1.97%，樣品室溫放置48 h略有下降后趨于穩(wěn)定，這表明在核磁優(yōu)化實驗條件下，儀器的精密度與方法穩(wěn)定性良好，使用峰面積法核磁定量檢測能滿足定量需求。

2.5.3 加標(biāo)回收實驗

通過回收率實驗準(zhǔn)確地衡量測定值與真實值的接近程度。如表8所示，以標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)，回收率在95.246 6%～109.054 6%之間，其RSD為5.495 2%。表明分析方法與測量系統(tǒng)準(zhǔn)確度良好。

表8 加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 8 Recoveries for spiked standards

2.6 樣品檢測與方法專屬性

將已制備待測樣品溶液溶于25 mL的無水乙醇，取0.5 mL用于HPLC檢測；剩余樣品經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，溶于5 mL的氘代氯仿溶液中，取1 mL到核磁管中，加入精密配制質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物吡嗪溶液0.5 mL，在優(yōu)化的核磁條件下檢測，分別采用核磁軟件MestRenova 9和Bruker Topspin3.6.2處理數(shù)據(jù)與譜圖，結(jié)果如圖5與表9所示。

圖5 雞油菌（A）、茶樹菇（B）與蟲草（C）樣品麥角固醇 定量峰去卷積擬合譜圖Fig. 5 Deconvoluted and curve-fitted spectra of quantitative ergosterol peaks of chanterelle (A), Agrocybe aegerita (B) and Cordyceps (C)

定量核磁研究中面積積分值的準(zhǔn)確性對定量結(jié)果有很大的影響。使用直接積分時，2 個相鄰峰的譜圖重疊以及基線都會對峰面積造成影響引起結(jié)果的偏差，可選擇直接普通積分和去卷積積分2 種積分方式對得到的氫譜譜圖進(jìn)行對比，能準(zhǔn)確獲取該化學(xué)位移處峰的面積信息。核磁譜圖中有峰重疊或受噪聲影響過大，當(dāng)對譜圖直接進(jìn)行積分（中切法）時，得到的面積有一定偏差，如表9所示?？墒褂萌ゾ矸e方法算出各峰的峰面積，將得到的譜圖用Bruker Topspin軟件，對需要去卷積的目標(biāo)峰部分進(jìn)行去卷積擬合積分，得到相應(yīng)的峰面積，如圖5所示。

表9 食用菌樣品核磁定量檢測結(jié)果（n =3）Table 9 Results of NMR for ergosterol in several edible fungi samples(n = 3)

核磁譜圖中峰的形狀主要是由洛倫茲（Lorenz）方程給出，實際檢測過程中，由于場的不均勻性和加權(quán)函數(shù)，會產(chǎn)生部分高斯（Gauss）線形狀，若單純采用洛倫茲或純高斯進(jìn)行去卷積擬合時，2 種峰去卷積擬合殘差較大，計算出的結(jié)果區(qū)別較大，在適當(dāng)情況下，多數(shù)對稱的峰均可調(diào)節(jié)高斯和洛倫茲線性比例以近似代替[32]，采用洛倫茲和高斯以一定比例進(jìn)行去卷積擬合時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洛倫茲比高斯為4∶1時，擬合曲線與原來的峰形最相似，且與HPLC測定的麥角固醇結(jié)果接近。從表9可知，經(jīng)擬合處理后積分，檢測結(jié)果較靠近HPLC檢測值，說明在樣品檢測以后進(jìn)行去卷積擬合處理，能得到更精確的定量值，這表明在樣品核磁檢測中，當(dāng)目標(biāo)定量峰周圍存在雜峰干擾時，無法精確積分得到較為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，可通過洛倫茲和高斯線性比例調(diào)節(jié)進(jìn)行去卷積分析，能排除雜峰的干擾，提高定量準(zhǔn)確性。

3 結(jié) 論

根據(jù)麥角固醇核磁譜圖質(zhì)子信號峰歸屬，以氘代氯仿作為溶劑與吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物，通過優(yōu)化核磁檢測參數(shù)建立1H-NMR檢測食用菌中麥角固醇的方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，通過食用菌樣品實證檢測，論證檢測方法專屬性與可行性。研究結(jié)果表明，麥角固醇核磁譜圖中C-18H化學(xué)位移δ0.63處的甲基質(zhì)子單峰可作為麥角固醇的目標(biāo)定量峰，以采集時間2 s、弛豫延遲時間15 s和掃描次數(shù)256 次作為優(yōu)化核磁檢測條件，麥角固醇與內(nèi)標(biāo)吡嗪的質(zhì)量比與峰面積之比呈良好的線性關(guān)系，可獲得穩(wěn)定的面積比值積分值，在0.55～5.30 mg/mg范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y=0.130 6X+0.008 3，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999 7；經(jīng)方法學(xué)評價，方法檢出限（RSN≥3）與定量限（RSN≥150）分別為0.001 8 mg/mL與0.045 0 mg/mL，方法的精密度與穩(wěn)定性RSD均小于2%；采用洛倫茲與高斯比例為4∶1時進(jìn)行去卷積擬合時發(fā)現(xiàn)，擬合曲線與原來的峰形最相似，并與HPLC法測定的麥角固醇結(jié)果相近，說明在樣品檢測后進(jìn)行去卷積擬合處理，能得到更精確的定量值；3 種食用菌實際樣品檢測驗證該方法的專屬性與可行性，表明建立的方法對于食用菌中麥角固醇定量檢測具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢。