陳小君，孟淑娟，吳 磊，曹福源，張艷淑,4

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.曹妃甸區(qū)工人醫(yī)院，河北 唐山 063000；3.唐山弘慈醫(yī)院，河北 唐山 063000；4.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063000)

長(zhǎng)期慢性鉛暴露可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)抑郁樣改變、錐體外系改變等癥狀[1-3]。隨著人們生活方式發(fā)生改變，高脂高糖飲食導(dǎo)致的肥胖發(fā)生率迅速上升。世衛(wèi)組織估計(jì)到2025年，全球超重或肥胖兒童將超過(guò)7000萬(wàn)，肥胖成人將超過(guò)8億[4]。肥胖不僅影響個(gè)體健康，還會(huì)對(duì)子代健康造成不利影響。

腸道菌群寄居在腸道，與宿主長(zhǎng)期共存，并參與宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫等生理功能[5-6]。有研究表明腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)在肥胖及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]?；谖⑸?腸-腦軸，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以通過(guò)神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌等途徑監(jiān)控、調(diào)節(jié)腸道菌群的變化，腸道菌群也可以通過(guò)自身或代謝產(chǎn)物影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8-9]。研究表明肥胖人群的腸道菌群數(shù)量和多樣性明顯降低，引起消化道炎癥的菌群占優(yōu)勢(shì)，使機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生或免疫細(xì)胞的平衡發(fā)生變化[10-11]。分析糞便移植對(duì)鉛暴露肥胖孕鼠子代腸道微生態(tài)及神經(jīng)行為的影響，以期為鉛暴露肥胖群體的健康防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4周齡SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。該研究經(jīng)過(guò)華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

32只雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、鉛暴露組、高脂組和高脂+鉛暴露組，每組8只。對(duì)照組食用普通飼料和常規(guī)飲水，鉛暴露組食用普通飼料、飲用含有500 mg·L-1醋酸鉛的飲用水，高脂組食用高脂飼料和常規(guī)飲水，高脂+鉛暴露組食用高脂飼料、飲用含有500 mg·L-1醋酸鉛的飲用水。連續(xù)喂養(yǎng)6周，定期監(jiān)測(cè)體重變化，建立肥胖母鼠模型。6周后按雌雄2∶1比例合籠，次日晨檢查陰栓確定懷孕。孕17 d前每籠飼養(yǎng)3～4只，孕17 d分籠，每籠飼養(yǎng)孕鼠1只。分娩后母乳喂養(yǎng)，為防止哺乳數(shù)不同影響血脂，出生后3 d處死多余子鼠，使每窩子鼠為5只，雌雄各半，母乳喂養(yǎng)21 d。每日觀察大鼠健康及活動(dòng)情況，每周記錄體重變化。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)測(cè)定

Morris水迷宮試驗(yàn)：PND60仔鼠經(jīng)過(guò)3 d適應(yīng)性學(xué)習(xí)后測(cè)定其學(xué)習(xí)記憶能力，記錄第4天在平臺(tái)120 s內(nèi)逃逸潛伏時(shí)間。

1.2.3 糞便溶液的制備及糞便移植

無(wú)菌條件下留取對(duì)照組PND21仔鼠糞便，將糞便混合后稱重，100 mg糞便溶解于50 mL無(wú)菌生理鹽水，渦旋器攪拌混勻，22 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，形成均一溶液，按照每日用量進(jìn)行分裝，凍存于-80 ℃冰箱。應(yīng)用灌胃法將糞菌溶液移植給鉛暴露組、高脂組、高脂+鉛暴露組PND21仔鼠，隔日1次，灌胃15次后，分為對(duì)照組(Ctl60)、鉛暴露組(Pb60)、高脂組(HF60)、高脂+鉛暴露組(HF-Pb60)、鉛暴露移植組(Pb60T)、高脂移植組(HF60T)、高脂+鉛暴露移植組(HF-Pb60T)，并按以前各組飲食方式繼續(xù)飼養(yǎng)至60 d(PND60)處死，無(wú)菌操作下收集孕鼠子代PND60大鼠糞便。

1.2.4 16S rRNA宏基因測(cè)序

對(duì)高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)按照引物長(zhǎng)度和Barcode信息獲得的序列，進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)歸并劃分。根據(jù)OTU在不同樣本中的豐度分布，分析每個(gè)樣本的多樣性水平以及各樣本(組)在不同分類水平的組成；根據(jù)16S rRNA測(cè)序信息分析各組菌群在門、目、屬水平的差異。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 糞便移植對(duì)鉛暴露肥胖孕鼠子代腸道菌群多樣性的影響

2.1.1 孕鼠子代PND60大鼠腸道菌群α多樣性分析

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別反映微生物群的豐富度和均勻度，通過(guò)二者研究菌群Alpha多樣性。與對(duì)照組比較，鉛暴露組、鉛暴露移植組、高脂移植組Chao1指數(shù)降低，高脂組、高脂+鉛暴露組、高脂+鉛暴露移植組Chao1指數(shù)升高，糞便移植能夠顯著改變鉛暴露組、高脂組的Chao1指數(shù)(P<0.05)(圖1 A)。與對(duì)照組比較，各組Shannon指數(shù)均有顯著改變，糞便移植能夠改變鉛暴露組、高脂組的Shannon指數(shù)(圖1 B)。結(jié)果表明糞便移植能夠影響鉛暴露肥胖孕鼠子代腸道菌群Alpha多樣性。

注：A Chao1指數(shù)；B Shannon指數(shù)

2.1.2 孕鼠子代PND60大鼠腸道菌群β多樣性分析

為進(jìn)一步分析各組腸道微生物多樣性的差異，采用OTUs信息構(gòu)建加權(quán)的Unifrac距離矩陣，并且基于此進(jìn)行主成分分析(principal composition analysis，PCA)。第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別解釋了總變量的49.07%和25.00%。Weighted UniFrac結(jié)果Anosim=0.521、P=0.001(圖2)，表明鉛暴露導(dǎo)致孕鼠子代腸道菌群構(gòu)成發(fā)生改變。

圖2 孕鼠子代PND60大鼠腸道菌群主成分分析

2.2 糞便移植對(duì)鉛暴露孕鼠子代腸道菌群構(gòu)成及相對(duì)豐度的影響

2.2.1 孕鼠子代腸道菌群OUT分類及門水平菌群構(gòu)成情況

孕鼠子代糞便經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，OTUs最多可達(dá)652，最少為213(圖3A)；門水平腸道菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Protebacteria)、放射菌(Actinobateria)、變形菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)構(gòu)成(圖3B)。

注：Phylum(門)；Family(目)；Genus(屬)；Species(種)。

注：厚壁菌門(Firmicutes)；擬桿菌門(Protebacteria)；放射菌(Actinobateria)；

2.2.2 糞便移植對(duì)孕鼠子代屬水平腸道菌群相對(duì)豐度的影響

根據(jù)OTU豐度分布或樣本間相似程度將PND60孕鼠子代腸道菌群各分類水平的群落組成加以聚類，在屬水平上，對(duì)豐度前50位屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖(圖4),主要菌屬包括Lactobacillus、Clostridium、Aggregatibacter、Pseudomonadac、Ruminococaceae、Osciilospira。與對(duì)照組比較，鉛暴露組Lactobacillus、Pseudomonadac及鉛暴露移植組、高脂組、高脂移植組、高脂+鉛暴露組Ruminococaceae相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，各組Clostridium相對(duì)豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；移植前后Lactobacillus、Clostridium、Pseudomonadac、Ruminococaceae相對(duì)豐度有顯著改變(P<0.05)，而Osciilospira僅在鉛暴露組和鉛暴露移植組間具有顯著差異，鉛暴露組、高脂+鉛暴露組移植前后Aggregatibacter改變顯著(P<0.05)(圖5)。

注：與對(duì)照組比較 aP<0.05；各組移植后與移植前比較 bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

2.3 糞便移植對(duì)孕鼠子代大鼠神經(jīng)行為的影響

PND60仔鼠經(jīng)過(guò)3 d適應(yīng)性學(xué)習(xí)后測(cè)定其學(xué)習(xí)記憶能力，記錄第4天在平臺(tái)120 s內(nèi)逃逸潛伏時(shí)間，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，鉛暴露組、高脂組、高脂鉛暴露組逃逸潛伏時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，鉛暴露移植組、高脂移植組、高脂鉛暴露移植組較移植前發(fā)生改變(P<0.05)(圖6)。

注：與對(duì)照組比較 aP<0.05；各組移植后與移植前比較 bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

3 討 論

鉛作為一種神經(jīng)毒物，廣泛存在于人們的生產(chǎn)和生活環(huán)境中，長(zhǎng)期慢性鉛暴露可導(dǎo)致胃腸道癥狀以及腸道菌群的改變[12]。

本研究結(jié)果顯示糞便移植能夠改變鉛暴露組、高脂組Chao1及Shannon指數(shù)，影響鉛暴露肥胖孕鼠子代腸道菌群多樣性。孕鼠子代門水平腸道菌群主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Protebacteria)、放射菌(Actinobateria)、變形菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，主要菌屬包括Lactobacillus、Clostridium、Aggregatibacter、Pseudomonadac、Ruminococaceae、Osciilospira；鉛暴露組Lactobacillus、Pseudomonadac菌群相對(duì)豐度升高，糞便移植后Lactobacillus、Pseudomonadac、Aggregatibacter相對(duì)豐度降低，而Clostridium、Osciilospira、Ruminococaceae相對(duì)豐度升高；高脂組在糞便移植后，Lactobacillus、Pseudomonadac相對(duì)豐度降低，而Clostridium、Ruminococaceae相對(duì)豐度升高；高脂加鉛暴露組在糞便移植后Lactobacillus、Pseudomonadac、Aggregatibacter相對(duì)豐度增加，而Clostridium、Ruminococaceae相對(duì)豐度降低，提示鉛暴露肥胖孕鼠子代存在腸道菌群紊亂，糞便移植有利于改善子代菌群構(gòu)成。

腸道菌群的早期發(fā)育受到多種因素影響，包括喂養(yǎng)方式、生活環(huán)境、抗生素、母親菌群等。Schultz等[13]研究顯示妊娠期母親服用益生菌，在出生后24個(gè)月的嬰兒糞便樣本中能夠檢測(cè)到；Gueimonde等[14]研究顯示妊娠期母親服用鼠李糖乳桿菌影響嬰兒腸道雙歧桿菌的定植，上述研究表明母代菌群結(jié)構(gòu)能夠影響子代菌群結(jié)構(gòu)。基于微生物-腸-腦軸的雙向調(diào)節(jié)，腸道菌群的改變也會(huì)影響神經(jīng)行為[15]，本研究中將正常大鼠糞便移植到鉛暴露組、高脂組、高脂鉛暴露組，Morris試驗(yàn)證實(shí)糞便移植后各組神經(jīng)行為發(fā)生改變。

綜上，探討糞便移植對(duì)鉛暴露肥胖孕鼠子代腸道微生態(tài)的影響，可為鉛暴露肥胖群體的健康防治提供新思路。