劉 京， 朱凱麗， 岳海旺， 李賀勤， 張海艷， 趙延明， 楊然兵， 尚書旗， 江緒文

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所， 山東 青島 266109；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所， 河北 衡水 053000)

種子是最基本的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，其萌發(fā)質(zhì)量直接關(guān)系農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成敗。種子萌發(fā)作為一個(gè)復(fù)雜的生理過程，根據(jù)定義它始于具有生活力的干種子吸脹作用，結(jié)束于胚根突破所有覆蓋層而伸出[1]。種皮作為重要種胚覆蓋層之一，是由數(shù)層起源于受精引起的胚珠被分化而形成的特殊細(xì)胞所組成[2]。目前關(guān)于種皮在調(diào)控種子發(fā)育、萌發(fā)等方面已取得一些進(jìn)展。Beeckman等[3]基于組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥種皮可能是在種胚發(fā)育階段與種胚協(xié)調(diào)作用下形成。Buzi等[4]發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)育后期許多與脅迫相關(guān)的蛋白會(huì)儲(chǔ)存在種皮中，使種子貯藏具有抗菌能力，并在調(diào)節(jié)種子壽命、發(fā)芽和幼苗建成中發(fā)揮重要作用。此外，種皮原花青素[5]、種皮黏液[6]等在對(duì)擬南芥、烏桕等種子萌發(fā)調(diào)節(jié)中均具有重要作用。因種皮特性而導(dǎo)致的不透水和(或)不透氧、機(jī)械限制等是導(dǎo)致許多植物種子休眠、萌發(fā)受阻的重要原因[7]。Khodakovskaya等[8]對(duì)番茄種子種皮穿刺處理后發(fā)現(xiàn)，種皮穿刺可加速種子內(nèi)部吸水，種子萌發(fā)12 d和20 d的發(fā)芽率比對(duì)照分別提高42%和11%。Duval等[9]發(fā)現(xiàn)，去除種皮可有效打破三倍體西瓜種子萌發(fā)障礙與種皮機(jī)械限制進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)，其中種子發(fā)芽率可提高70%。

玉米(ZeamaysL.)作為世界上最重要的糧飼、能源作物之一，在全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要的地位和不可替代的作用。種子質(zhì)量差一直是中國(guó)玉米生產(chǎn)發(fā)展和產(chǎn)量提高的一個(gè)重要限制因素[10-11]。Li等[11]對(duì)2013—2018年中國(guó)市售玉米品種種子質(zhì)量進(jìn)行了調(diào)研，發(fā)現(xiàn)種子質(zhì)量整體雖呈上升趨勢(shì)，但市售玉米品種在種子活力等方面仍存在遺傳缺陷，有待深入解析。馬潔等[12]發(fā)現(xiàn)劃傷果種皮后玉米種子吸水速率加快，與對(duì)照相比，中農(nóng)大4號(hào)活力指數(shù)提高0.229，苗長(zhǎng)增加0.7 cm。與其他植物相比，關(guān)于玉米果種皮對(duì)種子萌發(fā)及生理特性的影響研究甚少，包括其對(duì)果種皮破裂、胚根鞘破裂等種子萌發(fā)關(guān)鍵事件發(fā)生及重要種胚組織代謝調(diào)控機(jī)理等尚不清楚，非常值得深入探討。

本試驗(yàn)以不同玉米品種種子為材料，圍繞上述問題開展初步研究，以期為玉米種子萌發(fā)機(jī)理深入研究及高活力品種選育等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米品種為鄭單958、先玉335、蠡玉16和迪卡007；參照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T 3543.6-3543.7(國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局1995)[13]測(cè)得這4個(gè)品種種子千粒重分別為357.7、284.9、342.3 g和306.8 g，水分含量分別為11.7%、11.4%、11.5%和11.4%。各品種種子均為2019年收獲，低溫冷庫(kù)中干燥貯藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1果種皮特性測(cè)定

果種皮吸水特性觀測(cè)：參考《種子檢驗(yàn)學(xué)》[14]的方法，略有改動(dòng)。取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復(fù)，共150粒，將種子溫水(30～35 ℃)浸種4～8 h后，將其果種皮剝離收集并低溫烘干至恒重，備用。50粒種子的果種皮為1個(gè)重復(fù)，3次重復(fù)，于25 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行果種皮吸水特性測(cè)定，每隔10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，3.5 h，4 h取出試樣，輕拭表面浮水，稱重，計(jì)算果種皮吸水速率和最大吸水量。

果種皮厚度測(cè)定：取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復(fù)，共150粒，種子吸脹24 h后，沿中部縱切制片，用Leica DM 6 B顯微鏡結(jié)合配套圖像分析軟件對(duì)種子胚部、背部、底部的果種皮厚度進(jìn)行多點(diǎn)(>6)觀測(cè)，果種皮厚度以數(shù)據(jù)集最中部的3個(gè)數(shù)值的平均值表示。

覆胚果種皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)穿刺力測(cè)定：取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復(fù)，共150粒，利用自研的種子生物力學(xué)評(píng)價(jià)系統(tǒng)(A System for Automated Seed Biomechanical Assessment, ASASBA)進(jìn)行TCE穿刺力測(cè)定，TCE穿刺力以數(shù)據(jù)集最中部的3個(gè)數(shù)值的平均值表示。穿刺力測(cè)定主要參數(shù)為：探針直徑0.5 mm，移動(dòng)速度30 mm·min-1，環(huán)境濕度99%，環(huán)境溫度25 ℃。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)測(cè)定

參照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T 3543.4(國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局1995)[13]進(jìn)行卷紙發(fā)芽測(cè)定。取大小均一、健康飽滿的凈種子100粒，3次重復(fù)，共300粒，用1%次氯酸鈉溶液消毒10 min(包衣種子清水稍加清洗后消毒)，消毒后用蒸餾水沖洗3遍，拭去種子表面浮水后，備用。以移除TCE的種子為處理(用醫(yī)用手術(shù)刀在體視鏡下移除TCE)，未處理的種子為對(duì)照。取2張發(fā)芽紙(380 mm×255 mm，美國(guó)Anchor)疊放好，用油性記號(hào)筆標(biāo)識(shí)樣品信息，蒸餾水充分潤(rùn)濕后用無菌紗布輕拭床面，除去余液和紙間氣泡，種子交錯(cuò)置床，種孔朝向一致，紙邊距5 cm。置床后卷起放入自封袋，垂直置于人工氣候箱中(25±0.5)℃發(fā)芽(種孔端朝下，12 h光暗交替)。

逐日統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)目，發(fā)芽4 d計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽7 d計(jì)算發(fā)芽率，同時(shí)計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽天數(shù)。統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率的同時(shí)，隨機(jī)選取大小均一的10株種苗進(jìn)行芽(苗)長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、芽(苗)鮮重、根鮮重、芽(苗)干重和根干重等6項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，其中烘干條件為105 ℃烘8 h。

1.2.3總淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量測(cè)定

采用雙波長(zhǎng)法[15]、凱氏定氮法[16]和索氏提取法[17]分別測(cè)定樣品種子的總淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量；參照《種子學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[18]的方法進(jìn)行操作，3次重復(fù)。

1.2.4破裂測(cè)定

選取2個(gè)玉米種子萌發(fā)質(zhì)變事件： 1) 果種皮破裂：胚根鞘伸長(zhǎng)生長(zhǎng)突破果種皮； 2) 胚根鞘破裂：胚根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)突破胚根鞘或胚根鞘組織弱化破裂胚根伸出?；跇?biāo)準(zhǔn)發(fā)芽(同1.2.2)，種子置床后24、36、48、60、72、84、96 h和108 h統(tǒng)計(jì)果種皮破裂和胚根鞘破裂種子數(shù)，計(jì)算果種皮破裂率和胚根鞘破裂率。以移除TCE的種子為處理，未處理的種子為對(duì)照。

果種皮破裂率(%)=(果種皮破裂種子數(shù)/待測(cè)種子總數(shù))×100%；

胚根鞘破裂率(%)=(胚根鞘破裂種子數(shù)/待測(cè)種子總數(shù))×100%；

1.2.5酶活性測(cè)定

取足夠量的種子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽(同1.2.2)，以移除TCE的種子為處理，未處理的種子為對(duì)照。萌發(fā)60 h時(shí)收集種胚(已發(fā)生胚根鞘破裂)的胚中部(胚芽與胚根銜接部)、胚根和胚根鞘3部分組織，采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性[19]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性[18]；采用NBT光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性[20]。不同組織分別取約0.1 g樣品，6次重復(fù)，-80 ℃保存?zhèn)溆?；酶活性以?shù)據(jù)集最中部的3個(gè)數(shù)值的平均值表示。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、相關(guān)性分析和差異顯著性檢驗(yàn)(LSD法)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同玉米品種果種皮吸水特性比較

由圖1可見，4個(gè)玉米品種果種皮吸水量均呈快速吸水至平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，但不同品種果種皮最大值吸水量不同。其中鄭單958果種皮具有最大吸水量，為1.02 g·(50粒)-1。

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

2.2 不同玉米品種果種皮厚度及覆胚果種皮生物力學(xué)特性比較

由圖2可見，4個(gè)玉米品種間以及同品種不同部位間果種皮厚度不同。從TCE厚度來看，鄭單958最厚，為53.33 μm，且與其他3個(gè)品種差異顯著；4個(gè)玉米品種TCE穿刺力大小不同，鄭單958最大，為1.81 N，且與其他3個(gè)品種差異顯著。

注：同顏色不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 玉米TCE對(duì)種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可見，移除TCE能促進(jìn)玉米種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)，但對(duì)不同品種影響程度不同。從各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)來看，處理后鄭單958、先玉335和蠡玉16的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與對(duì)照相比均有所提高；處理后各品種平均發(fā)芽天數(shù)均顯著縮短，發(fā)芽指數(shù)也明顯高于對(duì)照且差異顯著，其中先玉335提高了58.10%。從各項(xiàng)幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)來看，處理后各品種芽(苗)長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、芽(苗)鮮重、根鮮重、根干重均明顯高于對(duì)照且差異顯著。

表1 TCE對(duì)4個(gè)玉米品種種子發(fā)芽的影響

2.4 玉米TCE指標(biāo)與其他性狀指標(biāo)的相關(guān)分析

由表2可見，TCE穿刺力與TCE厚度極顯著正相關(guān)。TCE穿刺力和TCE厚度2項(xiàng)指標(biāo)與平均發(fā)芽天數(shù)均呈正相關(guān)，與芽(苗)長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、芽(苗)鮮重、芽(苗)干重、根鮮重、根干重和種子粗脂肪含量均呈負(fù)相關(guān)，與種子總淀粉含量呈正相關(guān)，與種子粗蛋白含量分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。

表2 4個(gè)玉米品種TCE指標(biāo)與其他性狀指標(biāo)的相關(guān)分析

2.5 玉米TCE對(duì)種子萌發(fā)事件發(fā)生速率的影響

果種皮破裂和胚根鞘破裂是兩個(gè)重要的玉米種子萌發(fā)事件[21]。由圖3可見，4個(gè)玉米品種果種皮破裂率均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，而胚根鞘破裂率和(果種皮破裂+胚根鞘破裂)率2項(xiàng)指標(biāo)均呈快速增加至平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，移除TCE后4個(gè)玉米品種胚根鞘破裂率指標(biāo)變化速率均明顯上升，如：種子萌發(fā)60 h時(shí)，移除TCE后4個(gè)玉米品種胚根鞘破裂率均明顯高于對(duì)照，其中鄭單958提高了22.59%(圖3 B和圖3 D)。

注：A為對(duì)照果種皮破裂率變化趨勢(shì)圖；B為對(duì)照胚根鞘破裂率變化趨勢(shì)圖；C為對(duì)照(果種皮破裂+胚根鞘破裂)率變化趨勢(shì)圖；D為處理胚根鞘破裂率變化趨勢(shì)圖。

2.6 玉米TCE對(duì)種子萌發(fā)不同胚組織酶活性的影響

由圖4可見，種子萌發(fā)60 h，4個(gè)玉米品種胚中部、胚根和胚根鞘3部分組織中CAT、POD、SOD活性大小不同。從整體數(shù)據(jù)來看，CAT活性大小為胚根>胚根鞘>胚中部；POD活性大小為胚中部>胚根鞘、胚根>胚根鞘，但在胚中部和胚根之間的規(guī)律不明顯；SOD活性大小為胚中部>胚根鞘>胚根。移除TCE處理后，除鄭單958胚中部組織SOD活性與對(duì)照相比略有下降但差異不顯著外，其余品種處理后各組織3種酶活性均高于對(duì)照。

注：A、B和C分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織CAT活性測(cè)定結(jié)果；D、E和F分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織POD活性測(cè)定結(jié)果；G、H和I分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織SOD活性測(cè)定結(jié)果。

3 討 論

種皮作為種子重要覆蓋層，在種子發(fā)育、萌發(fā)等過程中發(fā)揮重要作用，包括為種胚發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，保護(hù)種胚免受不利環(huán)境影響等[22]。玉米種子萌發(fā)伴隨著果種皮破裂、胚根鞘破裂等重要萌發(fā)事件的發(fā)生，主要表現(xiàn)為胚根鞘伸長(zhǎng)生長(zhǎng)克服覆胚果種皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)機(jī)械限制以協(xié)助胚根伸出等方面[21]。特別是種子萌發(fā)中胚根伸出快慢可有效評(píng)價(jià)種子活力高低[23]，但目前關(guān)于果種皮特別是TCE對(duì)玉米種子萌發(fā)及生理特性的影響研究甚少，故本研究以鄭單958、先玉335、迪卡007和蠡玉16等4個(gè)玉米品種為材料，開展了以下相關(guān)工作。

3.1 不同玉米品種果種皮吸水特性及厚度比較

種子萌發(fā)吸脹速率與種被和內(nèi)含物致密度等有關(guān)[24]。不同植物種子吸水特性不同，王俊絹等[25]認(rèn)為，棉花種子的吸水率與種子活力存在顯著負(fù)相關(guān)；山金鳳等[26]發(fā)現(xiàn)，皇后帝王花種皮結(jié)構(gòu)對(duì)種胚吸水無阻礙，但可能對(duì)種胚呼吸、胚根伸長(zhǎng)存在影響等。在玉米方面，李文端等[27]指出不同類群玉米自交系間種子吸水速率無顯著差異，但在吸水時(shí)間上存在顯著差異；馬潔等[12]認(rèn)為，不同玉米品種吸水速率和活力水平不同，且與種子活力無明顯相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)玉米品種果種皮吸水量隨萌發(fā)時(shí)間推移均呈快速增加至平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，其中鄭單958果種皮吸水量最大，果種皮吸水特性差異可能會(huì)影響玉米種子萌發(fā)速率。此外，在種皮厚度方面，目前主要涉及其與種子硬實(shí)等相關(guān)的研究報(bào)道[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)玉米品種不同種子部位的果種皮厚度不同，其中鄭單958的TCE厚度最厚。

3.2 玉米TCE生物力特性對(duì)種子萌發(fā)的影響

從生物力學(xué)角度來看，種子由種胚和外圍組織層組成。種子萌發(fā)時(shí)，種胚感受外部環(huán)境信號(hào)激發(fā)自身組織伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而外圍組織層可能在種胚萌發(fā)活力水平恢復(fù)提升至閾值中扮演重要角色，只有當(dāng)種胚活力水平超過一定閾值時(shí)胚根才能順利伸出完成萌發(fā)[21,28]，故一些報(bào)道基于力學(xué)測(cè)量對(duì)胚乳等組織強(qiáng)度進(jìn)行分析，以研究種子萌發(fā)休眠機(jī)理。Müller等[29]利用自研裝備結(jié)合直徑0.3 mm的金屬探針，推進(jìn)速度2 mm·min-1成功檢測(cè)獨(dú)行菜種子萌發(fā)中胚乳的穿刺力大小。Holloway等[30]基于胚根鞘組織穿刺力測(cè)定闡述了小麥種子休眠和萌發(fā)新機(jī)制。本研究對(duì)4個(gè)玉米品種種子TCE進(jìn)行穿刺力測(cè)定以評(píng)價(jià)其機(jī)械強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)鄭單958最大，這可能與其厚度及果種皮內(nèi)所含物質(zhì)有關(guān)；相關(guān)性分析表明，TCE穿刺力與TCE厚度極顯著正相關(guān)。與對(duì)照相比，移除TCE處理后，4個(gè)玉米品種種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均有所提高，且平均發(fā)芽天數(shù)明顯縮短，種子萌發(fā)胚根鞘破裂率指標(biāo)變化速率明顯上升，且TCE越薄則其對(duì)種子萌發(fā)機(jī)械阻力越小，發(fā)芽速率更快。上述相關(guān)結(jié)論與馬潔等發(fā)現(xiàn)劃傷玉米果種皮處理可加快種子吸水速率[12]，進(jìn)而顯著提高種子的活力指數(shù)、幼苗長(zhǎng)度等指標(biāo)測(cè)定值的結(jié)論一致。此外，邢妍妍等[31]對(duì)不同生育期新鮮玉米種子和移除果種皮后種子的發(fā)芽情況進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)育初期移除果種皮可提高種子發(fā)芽率，但種子萌發(fā)后生長(zhǎng)緩慢，而本研究采用發(fā)育成熟的玉米種子，移除TCE不僅可提高種子發(fā)芽率而且一定程度上促進(jìn)了種苗形態(tài)建成。

3.3 玉米TCE對(duì)種子萌發(fā)不同種胚組織酶活性的影響

種子萌發(fā)伴隨著各種生理、生化和分子生物學(xué)變化以及相關(guān)形態(tài)特征的變化。胚根鞘作為禾本科植物種子特有器官，在玉米種子萌發(fā)中伸長(zhǎng)生長(zhǎng)與TCE發(fā)生生物力作用，以協(xié)助胚根伸出完成萌發(fā)[21]。研究TCE對(duì)玉米種子萌發(fā)不同種胚組織(包括胚中部、胚根、胚根鞘等)酶活性的影響對(duì)深入解析種子萌發(fā)機(jī)理非常重要。目前已有不少關(guān)于種子萌發(fā)酶活性變化的研究報(bào)道，Scheler等[32]研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)行菜種子細(xì)胞壁果膠甲基化與果膠甲基酯酶(PME)基因的特異表達(dá)和胚乳、胚根、下胚軸中相關(guān)酶活性有關(guān)，PME處理可提高種皮透性，促進(jìn)種皮破裂。本研究比較了4個(gè)玉米品種移除TCE處理的種子和未處理的種子在萌發(fā)60 h時(shí)，胚中部、胚根、胚根鞘組織CAT、POD、SOD活性變化情況，結(jié)果表明處理后各品種胚中部、胚根和胚根鞘組織CAT、POD、SOD活性基本呈上升趨勢(shì)；此外，不同種胚組織內(nèi)酶活性大小也存在一些規(guī)律，如：CAT活性大小為胚根>胚根鞘>胚中部，SOD活性大小為胚中部>胚根鞘>胚根。

本研究初步探討了果種皮特別是TCE對(duì)4個(gè)玉米品種種子萌發(fā)及生理特性的影響，并得到了一些重要結(jié)論，但在TCE與胚根鞘生物力作用機(jī)理、不同種胚組織間SOD等關(guān)鍵酶的活性大小差異產(chǎn)生機(jī)理、TCE對(duì)種胚組織內(nèi)源激素含量的影響以及對(duì)相關(guān)重要基因功能調(diào)控機(jī)制等方面還有待深入研究。